大鼠局灶性腦挫傷后p35及p25的表達(dá)變化

王漢志，李如波，王正印，張立軍

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)研究室，遼寧沈陽 110001；2.蘇州市公安局，江蘇蘇州 215000；3.調(diào)兵山市公安局，遼寧調(diào)兵山 112700）

大鼠局灶性腦挫傷后p35及p25的表達(dá)變化

王漢志1，2，李如波1，王正印1，張立軍3

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)研究室，遼寧沈陽 110001；2.蘇州市公安局，江蘇蘇州 215000；3.調(diào)兵山市公安局，遼寧調(diào)兵山 112700）

目的探討大鼠局灶性腦挫傷后腦中p35和p25表達(dá)變化的時(shí)間規(guī)律性，為腦損傷時(shí)間推斷提供更多依據(jù)。方法50只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為損傷即刻（0h）組，傷后6h、12h、24h、3d、5d、7d、10d組，同時(shí)設(shè)立正常組和假手術(shù)組，每組5只，建立大鼠局灶性腦挫傷模型，運(yùn)用HE、免疫組織化學(xué)染色及Western印跡法等方法檢測損傷不同時(shí)間后損傷周邊區(qū)腦組織p35及p25的蛋白表達(dá)。結(jié)果正常組和假手術(shù)組蛋白表達(dá)較多p35和少量p25。在局部腦挫傷后，p35隨時(shí)間呈現(xiàn)單峰變化，p25隨時(shí)間呈現(xiàn)雙峰變化。結(jié)論大鼠局灶性腦挫傷后p35和p25的表達(dá)呈現(xiàn)不同規(guī)律性并有較好的時(shí)間相關(guān)性，可為腦損傷時(shí)間推斷提供較好的依據(jù)。

法醫(yī)病理學(xué)；腦損傷；p35；p25；大鼠

腦損傷是法醫(yī)鑒定工作中的常見損傷之一，腦損傷時(shí)間的推斷對(duì)于各類案件的偵查和審判具有重要意義。目前法醫(yī)病理學(xué)者通過對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-3 （matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、caspase-3、突觸后致密物-95（postsynaptic density-95，PSD-95）及Homer蛋白等特異性蛋白在腦損傷后表達(dá)變化規(guī)律的研究[1-4]，為腦損傷時(shí)間推斷提供了科學(xué)依據(jù)。p35是一種有絲分裂后在神經(jīng)元中表達(dá)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5（cyclin dependent kinase 5，Cdk5）特異性激活因子，其蛋白表達(dá)水平?jīng)Q定神經(jīng)元中Cdk5的活性。p35/Cdk5激酶復(fù)合物可以磷酸化多種底物，參與神經(jīng)元遷移、軸突導(dǎo)向、微管穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等，與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)元正常功能的維持密切相關(guān)。在細(xì)胞毒性谷氨酸鹽、缺血缺氧等刺激下，p35可被鈣依賴性蛋白酶（calpain）裂解為p25[5]，p25具有更強(qiáng)的激活Cdk5的功能和更好的穩(wěn)定性[6]，可過度激活Cdk5而引起細(xì)胞凋亡等病理變化。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠局灶性腦挫傷模型[7]，檢測損傷不同時(shí)間后腦中p35和p25表達(dá)的變化并分析其時(shí)間規(guī)律性，為腦損傷時(shí)間的推斷提供更多有效的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 分組及模型建立

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康成年雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量280～310 g（由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），隨機(jī)分為10組，包括正常組，假手術(shù)組，損傷即刻（0 h）組，傷后6 h、12h、24h、3d、5d、7d、10d組，每組5只。

1.1.2 動(dòng)物模型制備及取材

損傷組將大鼠乙醚誘導(dǎo)麻醉后稱重，4%水合氯醛（30mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)，頭部備皮后正中切開頭皮，于人字縫前2mm、矢狀縫旁2mm處鉆一直徑5mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完整。用30g重錘從25cm高處落下，打擊暴露的腦組織，建立大鼠局灶性腦挫傷模型。假手術(shù)組以相同方法鉆骨窗，但不進(jìn)行打擊。正常組不進(jìn)行手術(shù)。術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng)，保持墊料清潔及空氣通暢。

分別于術(shù)后設(shè)定時(shí)間手術(shù)取出腦組織，沿冠狀方向?qū)⒋靷麉^(qū)腦組織分為兩份，一份放入4%多聚甲醛溶液中固定后制作蠟塊，用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色；另一份用于Western印跡法檢測蛋白表達(dá)。

1.2 試劑

兔抗大鼠p35/p25多克隆抗體（ab10570，美國Abcam公司），SP-9002免疫組織化學(xué)染色試劑盒（美國ZYMED公司），濃縮型DAB試劑盒（ZLI9018，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），多克隆山羊抗兔IgG （ZB-2305，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），ECL發(fā)光劑（sc-2048，美國Santa Cruz公司）。

1.3 HE染色

常規(guī)脫蠟，水化，蘇木素染色5min，1%鹽酸乙醇溶液分化，自來水洗15 min，伊紅復(fù)染3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

常規(guī)脫蠟，水化，微波修復(fù)，PBS充分浸洗，滴加3%過氧化氫滅活15min，PBS浸洗，滴加封閉用山羊血清，保濕盒內(nèi)孵育1 h，滴加一抗，4℃過夜，PBS浸洗，滴加二抗，保濕盒內(nèi)孵育30 min，PBS浸洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的SP試劑，保濕盒內(nèi)孵育30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。

1.5 Western印跡法

將提取的腦組織放入2 mL微量離心管中，并于冰上剪碎，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，勻漿。4℃下以離心半徑5.5 cm，12 000 r/min，離心15 min，取上清液，共3次，用BCA法測定蛋白濃度。先后灌注12%分離膠和4%濃縮膠，蛋白樣品加適當(dāng)比例上樣緩沖液，混勻并于100℃加熱5 min，向泳道內(nèi)加入20 μL樣品（含50 μg總蛋白）及標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker，電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉4h，滴加一抗4℃過夜，滴加HRP標(biāo)記的二抗，室溫下孵育2 h，TBST充分洗膜后滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組織化學(xué)染色陽性的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，顯微鏡下，神經(jīng)元胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為陽性著色，每張切片在腦挫傷區(qū)周圍200μm范圍內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（400倍），計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞總數(shù)以及陽性細(xì)胞率。采用上海天能公司GIS-700D凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)雜交條帶進(jìn)行掃描，以標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker作為標(biāo)識(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量在20000～40000為目標(biāo)陽性譜帶。以平均灰度值分析各個(gè)時(shí)間段條帶的濃度和大小。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

正常組和假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，核大、圓形、空亮，核仁明顯，胞質(zhì)較少。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞核深染，胞質(zhì)少。傷后0～12h組可見挫傷局部蛛網(wǎng)膜下腔出血，腦皮質(zhì)及深層腦組織出血，挫傷灶周圍神經(jīng)元核仁不清，尼氏體減少或消失，傷后3 d可見大量膠質(zhì)細(xì)胞增生，傷后5～10d挫傷區(qū)出血減少，細(xì)胞周圍間隙增寬，壞死組織吸收。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

正常組和假手術(shù)組p35/p25抗體陽性染色細(xì)胞較多，陽性染色較深（圖1A）；傷后0 h、6 h挫傷周邊區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)減少，陽性染色變淺（圖1B）；傷后12h陽性細(xì)胞數(shù)和陽性染色降低最明顯（圖1C）；傷后24 h陽性細(xì)胞數(shù)開始增多，傷后3～10 d陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，陽性染色逐漸加深（圖1D～F），并于傷后5d基本恢復(fù)至正常水平（圖1E）。腦挫傷后不同時(shí)間p35/p25免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞率見表1。

圖1 大鼠腦組織p35/p25免疫組織化學(xué)染色SP×400

表1 各組p35/p25免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞率（n=5，±s）

表1 各組p35/p25免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞率（n=5，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P〈0.05

組別陽性細(xì)胞率正常0.70±0.03假手術(shù)0.67±0.03傷后0h0.49±0.051）傷后6h0.48±0.03傷后12h0.42±0.061）傷后24h0.53±0.071）傷后3d0.58±0.03傷后5d0.67±0.051）傷后7d0.69±0.10傷后10d0.65±0.06

2.3 Western印跡法結(jié)果

正常組和假手術(shù)組p35蛋白表達(dá)量較多，挫傷后出現(xiàn)下降，于12 h降至低峰，隨后表達(dá)量逐漸升高，傷后5d時(shí)p35蛋白基本恢復(fù)正常表達(dá)量，呈現(xiàn)單峰變化。

在正常組和假手術(shù)組中僅有少量p25蛋白，挫傷后蛋白量升高并于6h達(dá)到高峰，隨后下降，24h降至低峰，之后再次升高，5d時(shí)出現(xiàn)第二次高峰，之后蛋白量逐漸下降，呈現(xiàn)雙峰變化（圖2，表2）。

圖2 各組p35和p25的蛋白表達(dá)

表2 各組p35和p25蛋白表達(dá)譜帶的灰度值變化（n=5，±s）

表2 各組p35和p25蛋白表達(dá)譜帶的灰度值變化（n=5，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P〈0.05

組別正常假手術(shù)傷后0h傷后6h傷后12h傷后24h傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d p35 242.04±8.37 239.90±7.87 116.53±12.411）111.65±10.11 80.52±5.721）108.11±15.121）184.97±14.701）238.06±11.911）235.70±11.74 235.45±13.53 p25 69.42±4.37 58.64±1.99 193.93±15.281）207.75±8.57 107.40±12.971）83.17±7.861）89.16±5.78 136.84±10.011）67.02±6.911）66.56±5.66

3 討論

p35在體內(nèi)主要通過泛素-蛋白酶體途徑降解，p25具有p35活性所需的全部氨基酸序列[8-11]，p25與Cdk5結(jié)合形成激酶復(fù)合物可過度磷酸化其適宜底物，如微管相關(guān)蛋白tau引起神經(jīng)絲纏結(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。

calpain是一種鈣離子依賴性半胱氨酸蛋白酶，在神經(jīng)元中含量豐富，主要以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，其活性主要由鈣離子濃度調(diào)節(jié)。calpain分為兩個(gè)亞型：μ-calpain和m-calpain，分別表達(dá)于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中[13-14]。當(dāng)calpain被鈣離子激活，其N末端結(jié)構(gòu)域裂解變?yōu)榧せ钚停梢詫35裂解為p25。有實(shí)驗(yàn)[15]表明，在大鼠局灶性腦損傷模型中calpain的表達(dá)隨損傷時(shí)間呈規(guī)律性變化，損傷15min后calpain表達(dá)增強(qiáng)，傷后12 h表達(dá)達(dá)到高峰，傷后24h表達(dá)減弱，傷后3d表達(dá)較24h增強(qiáng)，傷后5d再次達(dá)到高峰，隨后7～10d表達(dá)逐漸減弱，并于傷后15d逐步恢復(fù)至對(duì)照組水平，呈現(xiàn)出雙峰變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常組和假手術(shù)組中僅有少量p25蛋白，損傷后p25蛋白量增加，傷后6h達(dá)到高峰，傷后12h蛋白量逐漸下降，傷后24 h降至低峰，傷后3 d蛋白量出現(xiàn)升高，傷后5 d時(shí)再次達(dá)到高峰，隨后p25蛋白量再次下降，呈現(xiàn)與calpain規(guī)律一致的雙峰變化。其原因可能為鈍力性腦挫傷后引起缺血缺氧性腦損傷，短暫性腦缺血后鈣離子通過NMDAR通道和L型電壓門控鈣離子通道內(nèi)流，通過scr家族引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載[16]，大量激活細(xì)胞內(nèi)calpain，引起p25蛋白量升高。在本實(shí)驗(yàn)中，正常組和假手術(shù)組中有較多p35蛋白表達(dá)，鈍力性腦挫傷后p35蛋白表達(dá)持續(xù)下降，損傷12h后降至最低，其原因可能為損傷后機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，大量損傷蛋白的產(chǎn)生引起細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體水平升高，p35降解增多，而損傷后引起的calpain活性升高，裂解p35為p25也是其表達(dá)減少的原因之一。傷后24 h組p35蛋白表達(dá)量逐漸升高，損傷5 d后基本回復(fù)至正常水平，呈現(xiàn)規(guī)律的單峰變化。

腦挫傷時(shí)間推斷需要多指標(biāo)綜合分析判斷，一直是法醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一，目前仍需深入研究尋找與腦挫傷時(shí)間有良好相關(guān)性的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)在建立成熟穩(wěn)定腦挫傷模型的基礎(chǔ)上，對(duì)腦挫傷后p35及p25蛋白表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)具有時(shí)間規(guī)律，并與相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)規(guī)律一致，可為準(zhǔn)確推斷腦挫傷時(shí)間提供更多理論依據(jù)。

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Expression of p35 and p25 after Focal Cerebral Contusion in Rat

WANG Han-zhi1,2,LI Ru-bo1,WANG Zheng-yin1,ZHANG Li-jun3
（1.Department of Forensic Pathology,College of Forensic Medicine,China Medical University,Shenyang 110001,China;2.Public Security Bureau of Suzhou,Suzhou 215000,China;3.Public Security Bureau of Diaobingshan,Diaobingshan 112700,China）

Objective To study the expression of p35 and p25 in rat after focal cerebral contusion and to provide experimental data for estimating brain injury time.Methods Fifty adult male SD rats were randomly divided into 0 h,6 h,12 h,24 h,3 d,5 d,7 d,10 d after focal cerebral contusion,control and sham-operated groups（5 rats each group）.The focal cerebral contusion rat model was established.The expression of p35 and p25 protein of the damage peripheral zone in brain were detected by HE staining,immunohistochemistry and Western blotting at different injury time.Results A large number of p35 protein and a small amount of p25 protein were expressed in control group and sham-operated group. After focal cerebral contusion,p35 presented unimodal change with time and p25 presented bimodal changes with time.Conclusion Expression of p35 and p25 showed different regularity with good time correlation,which could help to estimate the brain injury time.

forensic pathology;brain injuries;p35;p25;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.004

1004-5619（2015）02-0093-04

2013-05-29）

（本文編輯：劉寧國）

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2013317）；遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014021027）

王漢志（1986—），男，山東煙臺(tái)人，碩士研究生，主要從事腦損傷時(shí)間推斷研究；E-mail：hanzhi3414＠163.com

李如波，男，博士，教授，主要從事腦死亡及彌漫性腦損傷的法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：rbli＠m(xù)ail.cmu.edu.cn