氣腫疽梭菌PCR檢測方法的建立

云巾宴　任春宇　車達　段雪巖　司唯　金鑫

摘要：為建立氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）的快速檢測方法，根據GenBank中氣腫疽梭菌細胞毒素CctA基因序列（登錄號：JQ692583.1）設計了1對引物，以氣腫疽梭菌標準株C54-1全基因組DNA為模板，建立了牛氣腫疽梭菌的PCR檢測方法，并進行了特異性、敏感性試驗。結果表明，建立的氣腫疽梭菌PCR檢測方法擴增出的片段大小為501 bp，與GenBank上氣腫疽梭菌的同源性達99.4%，且該方法與D型產氣莢膜梭菌、E型產氣莢膜梭菌、腐敗梭菌和巴氏桿菌等病原體無交叉反應，最低檢測濃度為12.30 fg/μL。結果表明，建立的PCR檢測方法具有特異、敏感、高效等優點，與其他診斷方法相比更適用于氣腫疽梭菌的診斷。

關鍵詞：氣腫疽梭菌；細胞毒素CctA；PCR診斷

中圖分類號： S858.23 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0053-03

氣腫疽別稱黑腿病，是由氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的以皮下組織和肌肉豐滿部位發生氣性、炎性腫脹，按壓之有捻發音為特征的急性、熱性和敗血性傳染病[1]。病牛是本病的主要傳染源，但并不直接傳染給健康牛，而是隨污染的土壤經飼料或飲水間接進入消化道而感染[2]。其芽孢能在土壤中長期生存，成為持久的傳染源。本病一年四季均可發生，尤以炎熱干旱的夏季容易發生，嚴冬則較為少見；呈地方性流行，低溫高濕、低濕山谷或低洼地區更易發生[3]。

由于氣腫疽梭菌的生長速度和其他梭狀芽孢桿菌相比較為緩慢[4-5]，因其與其他梭狀芽孢桿菌易發生交叉感染，所以很難從病原學和免疫學的角度對其病原體進行準確檢測[6]；因此建立快速高效的檢測方法顯得尤為重要。近年來，隨著生物技術的不斷發展，逐步建立了一些新的血清學診斷方法和分子生物學診斷方法。本試驗根據氣腫疽梭菌細胞毒素CctA基因設計了1對特異性引物，旨在建立靈敏、準確的針對氣腫疽梭菌的PCR檢測方法，對已發生氣腫疽病的牧場其他個體進行快速、高效的診斷，并廣泛應用于臨床實踐。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本及試劑

試驗樣本為氣腫疽梭菌C54-1標準株；Ex Taq DNA 聚合酶、DNTP、pMD 18-T Simple vector均購自大連寶生物工程有限公司；NI-DL3000 DNA marker購自Newbio industry公司；凝膠回收試劑盒、質粒少量提取試劑盒購自美國Omega生物技術公司；D型產氣莢膜梭菌、E型產氣莢膜梭菌、腐敗梭菌和巴氏桿菌均由延邊大學預防獸醫學實驗室保存。

1.2 引物的設計與合成

根據GenBank上氣腫疽梭菌細胞毒素CctA基因序列（登錄號：JQ692583.1），用Primer Premier 5.0設計了1對引物P1（5′-CGGGATCCGGTGGGTATTATCAAGC-3′）、P2（5′-CCCTCGAGAGTTCCTTTTGGTGC-3′），由北京新產業公司合成。

1.3 基因組DNA的提取

采用酚-氯仿抽提法提取氣腫疽梭菌菌體核酸DNA。

1.4 PCR反應體系及條件

PCR在25 μL反應體系中進行，雙蒸水16.25 μL、10×Ex Taq buffer 2.50 μL、DNA模板 2.00 μL、dNTP 2.00 μL和P1、P2各1.00 μL、Eq Taq 0.25 μL，共計25 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，48.8 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.5 PCR產物的回收、克隆及測序

PCR產物50 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收目的條帶；將回收產物與pMD 18-T simple vector進行連接，再轉化進DH-5α大腸桿菌感受態細胞內，繼而接種于含有氨芐抗性的LB固體培養基上，經37 ℃恒溫培養12～16 h，挑取單個菌落于含有氨芐抗性的液體培養基中增菌培養，并提取質粒，經PCR和酶切鑒定后將質粒送往上海立菲生物技術有限公司測序。將測序結果與GenBank中氣腫疽梭菌ATCC 10092菌株CctA基因進行同源性比較。

1.6 特異性試驗

將D型產氣莢膜梭菌、E型產氣莢膜梭菌、腐敗梭菌、巴氏桿菌的DNA按照氣腫疽梭菌的DNA濃度稀釋，用本研究建立的方法進行PCR擴增，并設陰性對照。

1.7 敏感性試驗

提取氣腫疽梭菌菌體DNA，測其D260 nm值，將DNA模板按1 ∶ 10比例連續稀釋后進行PCR擴增，以此來確定本PCR方法的敏感性。

2 結果與分析

2.1 氣腫疽梭菌CctA基因目的片段的PCR擴增

以氣腫疽梭菌菌體DNA為模板，經PCR擴增出了大小為501 bp的目的片段（圖1）。

2.2 目的基因的序列分析

將測序得到的結果與GenBank中氣腫疽梭菌ATCC 10092菌株CctA基因序列（JQ692583.1）進行同源性比較，結果顯示，核苷酸序列同源性達99.4%，共存在3處突變（圖2），表明該引物適用于氣腫疽梭菌的檢測。

2.3 特異性試驗

分別以氣腫疽梭菌、D型產氣莢膜梭菌、E型產氣莢膜梭菌、腐敗梭菌和巴氏桿菌的基因組DNA為模板，按照“1.4”節所述的擴增體系和反應條件進行PCR擴增，并以滅菌去離子水作陰性對照，后經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。結果顯示，只有氣腫疽梭菌擴增出目的條帶，而其他均未出現目的條帶，表明本試驗建立的PCR檢測方法具有較好的特異性（圖3）。

2.4 敏感性試驗

取氣腫疽梭菌菌體DNA標準品，按1 ∶ 10倍比稀釋后，用上述PCR方法進行檢測，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳觀察，結果表明，該PCR最低檢測量為12.30 fg/μL（圖4）。

3 討論

氣腫疽梭菌是引起氣腫疽的病原體，常隨污染的土壤經飼料或飲水間接進入消化道而感染[2]，也可經皮膚傷口或通過吸血昆蟲叮咬進行傳播[7]。該菌的芽孢潛伏期長、存活能力力強，能在土壤中長期生存，可成為持久傳染源，故很難從根本上預防和控制本病的發生及流行，這些特性嚴重制約了

畜牧業的發展。而隨著其易感群體的逐漸擴大，氣腫疽梭菌也越來越多地威脅到了人類的安全。

目前常用的檢測手段存在一定的弊端，病原學檢查和免疫學試驗都很容易與梭菌屬的其他細菌發生干擾，并不能達到良好的效果。與常規檢測方法相比，分子生物學方法更有優勢，可準確檢測低含量的病原菌。

本試驗以牛氣腫疽梭菌細胞毒素A（CctA）基因為基礎建立的PCR檢測方法，所獲得的序列與GenBank（登錄號JQ692583.1）上公布的序列同源性為99.4%，與產氣莢膜梭菌、腐敗梭菌、巴氏桿菌等病原體無交叉反應，證明其具有很好的特異性；最少可檢測到12.30 fg/μL的DNA，證明其具有較好的敏感性；說明本試驗建立的檢測方法可廣泛應用于對臨床樣本進行快速、高效的診斷，與其他診斷方法相比更適用于氣腫疽梭菌的診斷。

參考文獻：

[1]王正興. 山區牛氣腫疽診斷與防制[J]. 上海畜牧獸醫通訊，2011（2）：107.

[2]郭洪友，鄭 聃. 牛氣腫疽病的診治[J]. 現代農業科技，2010（7）：367，369.

[3]陸安法，徐官紅，簡廷安，等. 牛氣腫疽的防制[J]. 動物醫學進展，2003，24（6）：131-131.

[4]白 實，郭宇鵬，李艷華. 敦化地區黃牛氣腫疽的防治與診斷[J]. 吉林畜牧獸醫，2007，28（6）：38-39.

[5]Kuhnert P，Krampe M，Capaul S E，et al. Identification of Clostridium chauvoei in cultures and clinical material from blackleg using PCR[J]. Veterinary Microbiology，1997，57（2/3）：291-298.

[6]Halm A，Wagner M，Kfer J，et al. Novel real-time PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum in clostridial myonecrosis[J]. Journal of Clinical Microbiology，2010，48（4）：1093-1098.

[7]孫 瑛，雷國云，于林潔. 牛氣腫疽診斷與綜合防治[J]. 中國畜禽種業，2008（17）：59-60.劉廣卿，丁 芳，孫喜云，等. 速生高抗雄性楊的組織培養與快繁研究[J]. 江蘇農業科學，2015，43（10）：55-56.