雙單倍體馬鈴薯DM再生體系的構(gòu)建

張超　楊永智　王艦

摘要：以雙單倍體馬鈴薯（Solanum tuberosum）DM1-3-516-R44的無菌莖段、葉片作為材料，構(gòu)建馬鈴薯離體再生體系。結(jié)果表明，莖段愈傷組織適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基BI為MS+0.5 mg/L IAA+2.5 mg/L 6-BA，葉片愈傷組織適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基BN為MS+1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，愈傷的平均誘導(dǎo)率均達(dá)95%以上，甚至可以全部誘導(dǎo)愈傷形成；愈傷組織分化不定芽適宜的培養(yǎng)基BZ為MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT，分化率也達(dá)到90%左右。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；雙單倍體；愈傷組織誘導(dǎo)；再生體系

中圖分類號(hào)：S532.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0050-03

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是糧蔬兩用的經(jīng)濟(jì)作物[1]，我國對馬鈴薯的需求量日益增加。馬鈴薯于17世紀(jì)傳入我國，并迅速在我國西北地區(qū)大面積取代低產(chǎn)的糧食作物，成為當(dāng)時(shí)西北地區(qū)最重要的糧食作物之一[2]。由于馬鈴薯通過營養(yǎng)體繁殖，繁殖數(shù)代后會(huì)出現(xiàn)高染病率，從而影響馬鈴薯的產(chǎn)量、品質(zhì)[3]。近年來，隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、基因組學(xué)的發(fā)展，馬鈴薯的品質(zhì)得到極大提高。在我國，大多數(shù)學(xué)者以MS普通培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加適量的植物激素，以馬鈴薯莖段、葉片、薯塊等為材料得到再生植株[4]。由于不同品種馬鈴薯的基因型存在差異，導(dǎo)致馬鈴薯對植物激素的耐受性也不盡相同，因而各品種馬鈴薯的再生體系無法完全套用[5-11]。本試驗(yàn)所用材料為2011年測序成功的馬鈴薯品種，探究其再生體系，旨在為后續(xù)馬鈴薯基因表達(dá)、轉(zhuǎn)基因研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以2011年7月測序成功的雙單倍體馬鈴薯DM1-3-516-R44無菌試管苗（簡稱DM）為材料，在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，光照時(shí)間為14 h/d，白天采用日光燈補(bǔ)光。由于其長勢較弱，故采用生長近1個(gè)月的無菌苗作為材料。所用植物激素IAA、NAA、2，4-D、6-BA、ZT[12]以及試劑均為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

結(jié)合DM本身特性，利用植物分裂素IAA、NAA、2，4-D和植物生長素6-BA、ZT不同濃度配比來誘導(dǎo)愈傷組織形成、不定芽分化[9，13-17]。

1.2.1 莖段、葉片的愈傷組織誘導(dǎo) 選取生長30 d左右的DM無菌馬鈴薯試管苗，分別切下葉片、莖段，去除葉片邊緣。切取長為0.5 mm左右的莖段，不可帶生長點(diǎn)。分別將上述材料放入加有植物激素的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25～30 d。

為了得到更加合適的配比，設(shè)定植物分裂素與植物生長素配比從高到低為梯度，進(jìn)一步確定誘導(dǎo)莖段、葉片愈傷組織合適的植物激素配比。

1.2.2 愈傷分化不定芽培養(yǎng)基的選擇 將愈傷組織放入含有不同激素濃度配比的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。目前，學(xué)者們大多利用6-BA、NAA、GA3作為誘導(dǎo)芽分化的培養(yǎng)基[6，11，13，18-19]。結(jié)合本材料的特性以及前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選用不同濃度6-BA、ZT、IAA配比來確定分化誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基[11，20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

在6-BA和IAA激素組合中，大多數(shù)莖段在培養(yǎng)25 d左右時(shí)均有愈傷產(chǎn)生，當(dāng)6-BA濃度低于IAA時(shí)，部分愈傷容易生根；當(dāng)6-BA濃度與IAA濃度相差過大時(shí)，容易產(chǎn)生色絨毛狀的致密愈傷，且形成時(shí)間較長。在葉片中，大多數(shù)葉片出現(xiàn)發(fā)黃、死亡現(xiàn)象，有些會(huì)出現(xiàn)生根現(xiàn)象。所以由結(jié)果可知，IAA只適合莖段愈傷的形成（表1）。當(dāng)6-BA濃度過高時(shí)，部分葉片發(fā)黃、死亡；當(dāng)6-BA或NAA濃度過高時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生細(xì)根；當(dāng)NAA與6-BA濃度相當(dāng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生愈傷。莖段則部分不會(huì)形成愈傷或者愈傷過于疏松，呈透明膨大狀，因此可以推測NAA不適宜莖段的愈傷形成（表2）。表3中，6-BA與2，4-D大部分濃度配比會(huì)使莖段、葉片產(chǎn)生疏松愈傷并生根；部分配比會(huì)產(chǎn)生疏松、透明愈傷，即6-BA、2，4-D組合形成的愈傷不適于分化。植物分裂素IAA適合雙單倍體馬鈴薯DM莖段愈傷組織的誘導(dǎo)，植物分裂素NAA更適于雙單倍體馬鈴薯DM葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。只利用IAA或NAA時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率遠(yuǎn)低于添加6-BA的愈傷誘導(dǎo)率。添加高濃度6-BA時(shí)，莖段、葉片的誘導(dǎo)率也相對較低，甚至出現(xiàn)發(fā)黑、發(fā)黃的跡象。由表4、表5可知，莖段愈傷組織適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基BI為MS+0.5 mg/L IAA+2.5 mg/L 6-BA，葉片愈傷組織適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基BN為MS+1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA。

化均較好。當(dāng)6-BA濃度高于4 mg/L時(shí)，會(huì)延長愈傷組織分化所需時(shí)間。表7結(jié)果表明，6-BA與ZT適宜的濃度配比，不僅減少了愈傷組織分化時(shí)間，而且同時(shí)可作用于葉片、莖段愈傷。由表6、表7可知，影響愈傷組織分化效率最重要的因素是植物生長素濃度。當(dāng)6-BA濃度低于3 mg/L時(shí)，明顯發(fā)現(xiàn)愈傷組織分化時(shí)間延長，且分化的苗長勢較弱；當(dāng)6-BA濃度高于5 mg/L時(shí)，愈傷組織逐漸發(fā)黃，無法形成健康的幼苗。因此比較適宜的愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)基BZ為MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT。

3 結(jié)論

由于各種植物的基因存在差異，因此植物對激素的耐受性也存在很大區(qū)別。本試驗(yàn)經(jīng)過大量篩選，初步篩選出莖段愈傷組織適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基BI為MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 2.5 mg/L，葉片愈傷組織適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基BN為MS+1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，愈傷組織分化不定芽適宜的培養(yǎng)基BZ為MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT，這與前人研究結(jié)果[8-10，21]一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]曲 明，宋雅秋.糧蔬兩用作物——馬鈴薯[J]. 吉林農(nóng)業(yè)，2010（7）：74.

[2]張紹文，孫中偉.馬鈴薯史話[J]. 中國瓜菜，2008，21（4）：58-59.

[3]李彩霞.脫毒馬鈴薯種性退化對品種性狀的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（8）：49-51.

[4]方貫?zāi)龋嬍缑?馬鈴薯愈傷組織再生體系的研究進(jìn)展[J]. 中國馬鈴薯，2012，26（5）：307-310.

[5]肖關(guān)麗，郭華春.馬鈴薯內(nèi)源激素研究進(jìn)展[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，22（3）：431-434.

[6]羅 源，陳耀鋒，李春蓮，等. 馬鈴薯莖段愈傷組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，35（10）：159-162.

[7]李 云，盧其能，趙昶靈.影響馬鈴薯再生體系建立的主要因素[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（28）：15487-15489，15494.

[8]秦 敏，郜 剛.馬鈴薯再生體系的建立及其遺傳分析[J]. 中國馬鈴薯，2005，19（5）：270-273.

[9]齊恩芳，張金文，王一航.馬鈴薯莖段再生的植物激素配比優(yōu)化[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41（6）：14-17.

[10]張之為，趙 君，樊明壽，等. 馬鈴薯不同品種葉片再生體系的建立[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，29（1）：61-68.

[11]邱 礽，陶 剛，朱 英，等. 馬鈴薯品種莖段愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的研究[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（10）：11-13.

[12]楊立軍.植物生長物質(zhì)及其在馬鈴薯生長發(fā)育研究中的應(yīng)用[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（1）：49-52.

[13]李 云，盧其能，趙昶靈，等. 二倍體馬鈴薯野生種高效再生體系的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（1）：62-64.

[14]王 憲.二倍體馬鈴薯再生體系建立及耐鹽愈傷組織的篩選[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[15]晁祥健，楊 煜，金黎平，等. 二倍體馬鈴薯高效再生體系的建立[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2009，36（1）：109-114.

[16]楊 春.生長素和細(xì)胞分裂素在馬鈴薯愈傷組織分化中的作用[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（7）：40-42.

[17]石 虎，楊永智，周 云，等. 馬鈴薯新品種青薯9號(hào)高效再生體系的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：14-19.

[18]欒雨時(shí)，徐品三，夏秀英，等. 適于馬鈴薯莖段再生的植物激素配比選擇[J]. 中國馬鈴薯，2004，18（3）：143-144.

[19]黃雪麗.馬鈴薯莖尖脫毒、愈傷組織誘導(dǎo)及分化技術(shù)優(yōu)化研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[20]李 晶.馬鈴薯再生體系的建立及遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[21]姜國勇，薛 靜，張玉娜，等. 馬鈴薯轉(zhuǎn)化體系中愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)[J]. 萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，15（3）：7-10.云巾宴，任春宇，車 達(dá)，等. 氣腫疽梭菌PCR檢測方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：53-55.