基于cox1基因的貽貝科遺傳差異及系統發育關系

朱明　孟學平　趙軍　楊官品

摘要：基于線粒體DNA的細胞色素C氧化酶亞基1基因（cox1），分析貽貝科8個屬中13個物種的種間、種內遺傳差異及系統發育關系，結果表明，屬間遺傳距離為0.245～0.630，平均為0.487；同物種的母系和父系cox1遺傳距離為0.21～0.24；新西蘭綠唇貽貝與資料中的綠唇貽貝和Perna perna聚為1支，支持率為100%，后與翡翠貽貝聚為1支；13個物種中，除Trichomya hirsuta與貽貝屬種類聚為1支外，其余各屬均聚為單系支，貽貽屬Mytilus、股貽貝屬Perna、肌蛤屬Musculista 3個屬遺傳關系近。

關鍵詞：貽貝科；cox1基因；綠唇貽貝；遺傳差異；系統發育

中圖分類號： S917 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0023-05

貽貝科屬于軟體動物門瓣鰓綱貽貝目（Mytiloida），現有33個屬約250個種[1]。新西蘭綠唇貽貝Perna canaliculus（Gmelin，1791）、翡翠貽貝Perna viridis（Linnaeus，1785）隸屬于貽貝科股貽貝屬（Perna），紫貽貝Mytilus galloprovincialis （Lamarck，1819）屬于貽貝屬（Mytilus），翡翠貽貝和紫貽貝是我國主要養殖的2種貝類[2]。翡翠貽貝自然分布于西太平洋及印度洋熱帶和亞熱帶海域，我國主要分布在東海南部及南海；紫貽貝在世界上分布范圍非常廣，在我國被認為是1個外來種，目前南北沿海均有分布[3]；新西蘭綠唇貽貝是股貽貝屬中新西蘭特有的1個物種，是新西蘭的重要海產種質[4-5]，其脂溶性提取物有顯著的抗炎作用，對慢性關節炎具有很好的療效，在生活中得到廣泛應用[6]，新西蘭年養殖產值為1.90億美元[7]。有關貽貝科物種群體遺傳差異研究有許多報道[8-11]，如位正鵬等基于cox1基因研究了股貽貝屬3種貽貝的系統關系[12]，劉君等研究了cox1基因在貽貝科鑒定中的應用[13]，葉瑩瑩等基于16S rRNA基因研究了厚殼貽貝4個群體的遺傳結構[14]。有關綠唇貽貝幼蟲附著變態的研究也有較多報道[7，15-16]，但綠唇貽貝的分子系統學研究未見報道。本試驗通過擴增新西蘭綠唇貽貝、翡翠貽貝和紫貽貝的cox1片段，研究其序列結構特點、序列差異水平，并結合GenBank檢索到的貽貝科cox1序列，分析其系統演化關系，為生物入侵監測及貽貝科國際種質資源交流管理提供理論依據和技術手段，也為貽貝科類群的系統演化關系提供資料，對我國貽貝的養殖及綠唇貽貝的引種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本

綠唇貽貝6個個體，采于新西蘭奧克蘭；翡翠貽貝18個個體，采于福建廈門；紫貽貝15個個體，采于江蘇連云港。取閉殼肌備用。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

采用CTAB法裂解組織，酚-氯仿抽提、乙醇沉定法獲得總DNA。綠唇貽貝和翡翠貽貝cox1片段長為750 bp，擴增所用引物為ACOIF：5′-CGDATTCARCTWTCTCAYCCHGG-3′和ACOIR：5′-AMMGTAAAYATRTGRTGMGCCC-3′；紫貽貝cox1片段為889 bp，擴增所用引物為Med-cox1-F：5′-TGGGGTCTGAGGAGGTTTGT-3′和Med-cox1-R：5′-CCCTGTAGGGACTGCGATTA-3′。PCR擴增程序：94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，35個循環；72 ℃延伸 1 min。反應體系為25 μL，Taq酶1～2 U。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，將有效擴增PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司用ABI-PRISM 3730測序儀雙向測序。

1.3 序列比對分析

測序獲得的原始DNA序列用DNAStar軟件包中的SeaMan軟件組裝，結合測序峰圖進行人工校對，獲得可靠的DNA序列；用ClustalX軟件對DNA序列進行排序，將5′、3′端取齊，轉換成 .meg文件；用DnaSP 5.0軟件檢測單倍型，用Mega 4軟件分析序列特征，計算遺傳距離，構建NJ （K2-P法）系統進化樹，進行遺傳差異分析；GenBank中檢索貽貝科cox1序列資料，與本試驗序列資料一起分析貽貝科屬間、種間遺傳差異及系統發育關系。

2 結果與分析

2.1 3種貽貝的cox1序列差異分析

由表1可見，經測序拼接和人工校對，從新西蘭綠唇貽貝、翡翠貽貝和紫貽貝3種貝類cox1片段中共獲得39條序列，其中綠唇貽貝6條，翡翠貽貝18條，紫貽貝15條，校對后cox1的PCR產物可信長度紫貽貝為850 bp、綠唇貽貝和翡翠貽為730 bp左右；5′、3′端取齊進行核苷酸差異分析，共檢測到20種單倍型，其中綠唇貽貝6個個體有5種單倍型，翡翠貽貝18個個體有6種單倍型，紫貽貝15個個體有9種單倍型，3種貝類種間無共享單倍型。綠唇貽貝、翡翠貽貝和紫貽貝cox1單倍型G+C含量明顯低于A+T含量，平均分別為0.362、0.340、0.373。由圖1可見，3種貽貝20種單倍型進行序列比對，共有665個比對位點，其中變異位點由248個，占37.3% （圖1中僅列出180個變異位點）；綠唇貽貝與翡翠貽貝cox1變異位點有195個，占變異位點的29.3%，紫貽貝與綠唇貽貝和翡翠貽貝之間核苷酸變異位點分別為212和197個，分別占變異位點的31.9%、29.6%；綠唇貽貝、翡翠貽貝、紫貽貝3種貽貝種內個體間的核苷酸變異位點分別占變異位點的1.7%、1.5%、3.3%，與紫貽貝相比，綠唇貽貝與翡翠貽貝間核苷酸差異較小，共享變異位點相對較多，但cox1片段不同部位共享變異位點多少有不同。圖1中下方左側方框10個堿基中有7個共享變異位點，右側方框中只有2個共享變異位點，有8個非共享變異位點分布在連續的25個堿基序列中，此區域可用于設計區分2種貽貝的PCR特異引物。

2.2 3種貽貝的遺傳距離

基于cox1核苷酸序列的遺傳距離顯示，綠唇貽貝（LYB）、翡翠貽貝（FCYB）和紫貽貝（ZYB）的種內遺傳距離分別為0.007、0.005和0.014，種間遺傳距離為0.242（LYB-FCYB）、0.355（ZYB-FCYB）、0.393（ZYB-LYB）；綠唇貽貝與翡翠貽貝同屬股貽貝屬，其差異屬于屬內種間差異，因此兩兩遺傳距離相對小，而綠唇貽貝、翡翠貽貝與紫貽貝遺傳距離相對較大。

2.3 貽貝科貝類cox1核苷酸差異分析

從GenBank檢索到貽貝科13個物種403條cox1片段序列（表2）用于分析種內遺傳距離，結果表明，加里弗尼亞貽貝（Mytilus californianus） 440 bp的cox1片段核苷酸序列92個個體為M型、87個個體為F型，種內個體間遺傳距離平均分別為0.004、0.010，M型與F型間的遺傳距離為0.244；Geukensia demissa 57個序列間遺傳距離0.000～0.026，平均為0.013；Limnoperna pulex 38個序列間遺傳距離為0.000～0.053，平均為0.026；Mytilus edulis 26個序列間遺傳距離，M型為0.009，F型為0.012，M型和F型之間的遺傳距離為0.244；翡翠貽貝cox1（409 bp）片段20個序列的遺傳距離為0.000～0.012，平均為0.005；基于33個 cox1片段（454 bp）的紫貽貝，其平均遺傳距離為0.035，根據序列特征可將其序列分為3組即Mga1、Mga2和Mga3，其組內遺傳距離分別為0.007、0.008、0.035，Mga1和Mga2間的遺傳距離為0.019，Mga3和Mga1、Mga2間的遺傳距離分別是0.062、0.063，Mga3存在明顯的遺傳分化，Mga1和Mga2間無分化；基于cox1片段（500 bp）Perna perna 20個序列的遺傳距離為0.000～0.007，平均為0.004；油黑殼菜蛤（Mytilus trossulus） 12個cox1片段核苷酸序列差異較大，遺傳距離為0.000～0.228，平均為0.162，可分成4組，即Mtr1～Mtr4（圖2），4個組的組內遺傳距離依次為0.018、0.005、0.014、0，Mtr1與Mtr2間的遺傳距離為0.159，其余組間遺傳距離為0.212～0.228，雖為同一個種，但差異達到種間差異水平，聚類時也明顯分為4支，這可能是由于Mtr3在資料中標為M型，Mtr3與Mtr1、Mtr2間的分歧是由M、F型線粒體基因組DNA間的差異造成；樣本DQ198225未標明是F型或M型，與其余11個序列的遺傳距離為0.221～0.227，平均為0.220；綠唇貽貝cox1片段（467 bp）共14條，種內遺傳距離為0.000～0.015，平均為0.007。

2.4 貽貝科系統演化關系分析

將從GenBank檢索到的貽貝科403條序列與本試驗39條序列一起進行貽貝科系統發育分析，因不同學者所用cox1片段序列在cox1全長中的位置和長短不同，經兩頭取齊，共獲得長度為378 bp的單倍型38種，涵蓋13個物種，根據單倍型構建NJ樹。由圖3可見，13個物種隸屬于8個屬，除毛貽貝屬（Trichomya hirsute）與貽貝屬種類交叉聚為1支外，其余各屬均聚為單系支。本試驗新西蘭綠唇貽貝與資料中的綠唇貽貝（DQ917607，AF286188）聚為1支，另一來源的綠唇貽貝（DQ343592）與Perna perna（DQ343595）聚為1支，支持率為100%，這2支合聚為1支，支持率為51%；本試驗的翡翠貽貝與資料中的翡翠貽貝（NC018362）聚為1支，支持率為100%；紫貽貝與加里福尼亞貽貝、毛貽貝聚為1支，貽貝屬與毛貽貝遺傳關系較近；連云港紫貽貝與資料中的紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）[FJ890849（F型）、DQ399833（M型）、NC006886（Mytilus spp.）]和Mytilus edulis（NC006161）聚為單系支，支持率100%，而紫貽貝Mytilus galloprovincialis （FJ890850）M型線粒體cox1與Mytilus edulis（AY823623）線粒體DNA聚為1支。由表3可見，8個屬間的遺傳距離為0.254～0.630，平均為0.486；貽貝屬與Modiolula屬間遺傳距離最大，貽貝屬與毛貽貝屬間遺傳距離最小。

3 結論與討論

3.1 綠唇貽貝的分類地位

貽貝科股貽貝屬目前認定的物種有3種，即新西蘭綠唇貽貝、翡翠貽貝和P. perna （Linnaeus，1758），通過外部形態很難辯認這3種貽貝[5]。P. perna原產于亞洲西部和南部及南美洲大西洋沿岸，近年來已經入侵墨西哥灣沿海水域；翡翠貽貝自然產于亞洲沿海水域，從波斯灣到中國南方海域，現太平洋島國和墨西哥灣、美國南部的太平洋沿海水域均有發現；

綠唇貽貝僅產于新西蘭沿海水域。試驗綠唇貽貝樣本（LYB）來源于新西蘭的奧克蘭海域，與股貽貝種類聚為1支，但沒有與資料中的綠唇貽貝（DQ343592）直接聚在一起，綠唇貽貝（DQ343592）與Perna perna （DQ343595）先聚為1支，而后與LYB聚在一起，這說明LYB與資料中提及的綠唇貽貝（DQ343592）親緣關系相對遠，資料中提及的綠唇貽貝樣本同樣采自新西蘭，但具體采集地尚不清。基于cox1的遺傳距離顯示，Perna perna （DQ343595）與資料中綠唇貽貝（DQ343592）的遺傳距離為0.003，而資料中的綠唇貽貝與LYB的遺傳距離為0.167～0.180，接近Perna perna （DQ343595）和LYB間的距離，試驗綠唇貽貝與資料中提及的綠唇貽貝間遺傳差異大，達到種間差異水平。試驗測定綠唇貽貝的cox1片段序列與大部分綠唇貽貝序列相似性很高，與綠唇貽貝（DQ343592）差異大，因此，綠唇貽貝（DQ343592）的分類地位有待進一步考證。Blair等認為，單獨通過形態特征，很難辯認股貽貝屬的3種貽貝[5]，而cox1序列分析有助于股貽貝屬種類的識別。