灰黃霉素中去氯灰黃霉素雜質的提取和分離

呂書陽 李樹學(赤峰艾克制藥科技股份有限公司，內蒙古 赤峰 024000)

灰黃霉素(griseofulvin)，屬于芳香族衍生物類抗生素，分子式為C17H17ClO6，相對分子質量為352.77。生物合成灰黃霉素過程中，缺少氯離子或氯化反應受阻時，灰黃霉素的合成量下降甚至不能產生，會通過一個分支反應途徑，形成去氯灰黃霉素。去氯灰黃霉素抗真菌的活性很弱，會嚴重影響灰黃霉素的使用效果，是灰黃霉素發酵產物中的主要雜質，所以必須嚴格控制灰黃霉素產品中去氯灰黃霉素的含量。而在質量控制和檢驗過程中，需要去氯灰黃霉素的純品作為對照標準品。本文探討了從灰黃霉素中提取和分離去氯灰黃霉素的條件和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品及來源:灰黃霉素產品:由赤峰制藥股份有限公司提供；試劑為分析純，設備儀器為實驗室常規使用設備。

1.2 實驗方法

1.2.1 薄層層析法考察洗脫劑的條件:通過HPLC法測得灰黃霉素產品中去氯灰黃霉素的含量為0.3%。根據相關文獻可知，去氯灰黃霉素在丙酮和N，N-二甲基甲酰胺中具有較大的溶解度，故分離去氯灰黃霉素的展開劑由乙酸乙酯與正己烷組成。本實驗以不同配比的展開劑進行薄層層析對比分離效果，并對比采用丙酮和N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑的分離效果。

1.2.2 硅膠柱層析

a準備工作:取一柱長45cm，直徑約3cm的下端有沙漏和活塞的玻璃層析柱，洗凈，涼干。取層析硅膠200克于大燒杯中，加入配好的比例為正己烷:乙酸乙酯為1:3的展開劑至層析硅膠完全浸沒，密封，放置24小時。

b裝柱:向浸泡后的層析硅膠中加入適量展開劑，用玻璃棒攪起硅膠沉淀，然后將渾濁夜倒入玻璃柱中然后靜止，待硅膠沉淀完全，放出適量展開劑，再以同樣的方法將剩下的層析硅膠裝入柱內，靜置至沉淀完全，始終保持液面高于層析硅膠上面。

c樣品溶液配制:稱取約30g的灰黃霉素產品于100mL錐形瓶中，加入展開劑至100mL的刻度線處，置于超聲波儀器中超聲30min，取出靜置至沉淀完全，將上清液用濾紙過濾后收集濾液，待用。

d層析分離:將過濾后的樣品溶液加入到層析柱中，加入樣品溶液的高度約4cm，流速每秒1-2滴，用50mL錐形瓶接流出液，做薄層層析，收集帶有去氯灰黃霉素斑點的流出液。

經過柱層析，灰黃霉素和去氯灰黃霉素并未成功分離，可能是溶劑丙酮影響了展開劑的比例，使層析效果不佳。改為N，N二甲基甲酰胺溶劑后，分離效果理想。去氯灰黃霉素在灰黃霉素產品中含量很少，須經多次硅膠柱層析，將所有收集到的去氯灰黃霉素溶液合并，進行濃縮結晶，才能得到一定量的去氯灰黃霉素溶液。

1.2.3 濃縮與結晶:將含有去氯灰黃霉素組分的合并洗脫液用旋轉蒸發儀進行濃縮，60℃條件下蒸餾，將得到的剩余溶液倒入干凈的錐形瓶中，加入少量水，即有白色晶體析出，經過濾、洗滌、干燥，即得去氯灰黃霉素結晶。

1.2.4 產物的純度檢查:采用反向HPLC法，以乙腈:水=35:65為溶劑，以乙腈:水:冰乙酸=40:50:1為流動相。采用面積歸一化法計算產品的純度，在相同條件下測定去氯灰黃霉素和灰黃霉素產品的色譜圖。

2 結果

2.1 薄層層析法考察洗脫劑的條件

2.1.1 丙酮作為溶劑時薄層層析法結果:各比例展開劑的薄層層析實驗圖如圖1，其中1為去氯灰黃霉素，2為灰黃霉素。其中展開劑正己烷:乙酸乙酯的比例分別為:a=1:1，b=1:2，c=1:3，d=2:1，e=3:1。由圖可知，樣品中物質分離且樣品點展開位置比較理想的是正己烷:乙酸乙酯為1:3的展開劑。

2.1.2 N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑時薄層層析法結果:不同溶劑所得薄層色譜圖效果如圖2。其中1為去氯灰黃霉素，2為灰黃霉素。f是以N，N二甲基甲酰胺為溶劑，g是以丙酮為溶劑。對比可知，以N，N二甲基甲酰胺為溶劑時，樣品中物質分離較好，且樣品點展開位置比較理想。

圖1 、同配比展開劑所得薄層色譜圖

圖2 、不同溶劑所得薄層色譜圖

2.2 硅膠柱層析結果

采用HPLC面積歸一化法計算去氯灰黃霉素的純度為90.5%，保留時間為10.640，譜圖見圖3。在相同條件下測定灰黃霉素產品中去氯灰黃霉素的保留時間為10.429，譜圖見圖4。

圖3 去氯灰黃霉素溶液HPLC圖譜

圖4 灰黃霉素產品溶液HPLC圖譜

3 結語

通過實驗分析可知，在展開劑中正己烷:乙酸乙酯為1:3時，灰黃霉素和去氯灰黃霉素有較好的分離效果，因此選擇正己烷:乙酸乙酯(1:3)的展開劑為柱層析的洗脫劑，以N，N二甲基甲酰胺為溶劑，分離得到的去氯灰黃霉素，其HPLC主峰保留時間(t=10.640min)與灰黃霉素產品中去氯灰黃霉素峰的保留時間(t=10.429min)基本一致，說明所得產物為去氯灰黃霉素，且純度可達90.5%。

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