基于響應面法的土霉素高產菌株S189發酵培養基優化

王 明(1．天津科技大學生物工程學院，天津300457;2．寧夏泰瑞制藥股份有限公司，寧夏銀川750101)

土霉素(Oxytetracycline，OTC)是20世紀40年代發現的四環素族成員，是一種廣譜抗菌藥物，在醫療、畜牧業和農業領域具有廣泛的用途和廣闊的市場前景［1］。目前土霉素均采用龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)通過發酵法生產。影響土霉素發酵產量的因素較多，主要包括菌株自身的生產能力、發酵培養基以及發酵條件參數，其中研究主要集中在生產菌株的選育［2－4］。在工業化生產中，由于土霉素發酵培養基組成較復雜，玉米漿、黃豆餅粉等原料質量差異較大，易帶來發酵過程與目標產物產量的波動。響應面方法(Response Surface Methodology，簡稱RSM)在優化研究中應用頻繁，是降低開發成本、優化加工條件、提高產品質量、解決生產過程中實際問題的一種有效方法，已廣泛應用于農業、生物、食品、化學、制造等領域［5－7］。目前寧夏泰瑞制藥股份有限公司土霉素生產工藝優化課題組采用菌種誘變技術成功篩選得到一株土霉素高產菌株S189，筆者采用響應面法優化發酵培養基，為該菌株發酵性能的發揮提供良好條件。

1 材料與方法

1．1 菌種 土霉素高產菌株:龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)S189，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究所保存。

1．2 培養基 斜面培養基:麩皮70 g/L和瓊脂25 g/L，pH調至6．8 ～7．0。種子培養基:淀粉 16 g/L，糊精 12 g/L，黃豆餅粉5 g/L，玉米漿2 g/L，硫酸銨4 g/L，氯化鈉4 g/L，碳酸鈣4 g/L。發酵培養基:黃豆餅粉25 g/L，玉米漿8 g/L，淀粉75 g/L，硫酸銨8 g/L，氯化鈉2 g/L，碳酸鈣6 g/L，磷酸二氫鉀0．3 g/L。配制培養基時先用培養基總體積50%的純化水將淀粉溶解后，加入淀粉總質量0．006 5%的高溫淀粉酶，放入沸水浴中邊攪拌邊糊化，約20 min，再于其他成分混合配制。

1．3 培養方法 斜面培養:(36．5 ±1．0)℃，65 ～72 h，(30．0±1．0)℃，20～24 h。種子培養:將已生長好的斜面孢子刮(2～3)cm2至種子培養基中，(30．0 ±1．0)℃，230 r/min 培養20～24 h。發酵培養:用吸管吸取一定量已生長好的種子液，接入發酵瓶中，(30．0 ±1．0)℃，230 r/min 培養150 ～192 h。

1．4 分析方法 將發酵液用草酸酸化至pH 1．50～1．70，放置5 min，用中速濾紙過濾至5 ml以上，吸取濾液稀釋適宜倍數(使稀釋后效價在標準曲線范圍內)，用移液管吸取1 ml稀釋液于試管中，準確加入0．01 mol/L鹽酸，使總體積為20 ml，再加入0．05%(g/ml)的三氯化鐵溶液10 ml，使總體積為20 ml，搖勻，放置20 min。另取1 ml稀釋液，加入0．01 mol/L的鹽酸19 ml，使總體積為20 ml，搖勻，放置20 min，作為空白，放置20 min。在480 nm波長下測定2種液體吸光度。將測定的吸光度值代入標準曲線方程，再乘以稀釋倍數即得效價。土霉素效價的測定:采用紫外分光光度計法，參照文獻［2］。

1．5 Packett-Burman試驗設計(簡稱PB試驗) 根據前期發酵經驗和單因素試驗結果，選取培養基中7個因素，進行N=12的 Packett-Burman設計試驗，篩選出重要影響因子［8－10］。

1．6 最陡爬坡試驗 響應面擬合方程只有在接近最佳值區域才近似真實情況，因此要先逼近此區域才能建立有效的響應面擬合方程，通常用最陡爬坡法快速逼近最佳值區域。最陡爬坡法以PB試驗結果為依據，爬坡路徑與主要因素的效應一致。對篩選出的因子根據方程進行最陡爬坡設計，以坡的最高點作為后續中心組合的中心點。

1．7 響應面分析 根據PB和最陡爬坡試驗結果找到的中心點，利用Design-Expert響應面分析中的中心組合設計方法(CCD)進行試驗［8］，得到優化后的理論結果，進行3次重復驗證。

2 結果與分析

2．1 PB試驗設計及影響顯著因子的確定 采用Design-Expert．V8．0．6 軟件中 Packett-Burman 試驗設計，根據龜裂鏈霉菌的發酵特點，采用N=12的PB設計表，對發酵培養基中黃豆餅粉(A)、玉米漿(B)、淀粉(C)、硫酸銨(D)、氯化鈉(E)、碳酸鈣(F)、磷酸二氫鉀(G)7個因素進行考察。每個因素取高、低2個水平，培養160 h，發酵液經草酸酸化過濾后采用分光光度計檢測土霉素效價(mg/L)，作為PB試驗的響應值(Y)，另設3個虛擬變量，考察試驗誤差，試驗設計及結果分析見表1、2。

表1 PB試驗因素水平及編碼 g/L

表2 PB試驗設計與結果

方差分析結果表明，PB試驗中變量A、變量B、變量F均顯著。變量A、B、F的模型貢獻率較高，為構成模型的主要因素。因此，玉米漿、黃豆餅粉、碳酸鈣是影響土霉素發酵效價的重要因素，利用軟件可得到關于響應值的多元一次回歸方程:Y=21．28+2．66 A+1．68 B+1．31 C －0．21 D+0．28 E+2．59 F+0．042 G，R2=0．929 2，所選模型顯著。

2．2 爬坡試驗 最陡爬坡法以PB試驗結果為依據，爬坡路徑與主要因素的效應一致。黃豆餅粉、玉米漿、碳酸鈣均呈正效應增加，根據這3個因素效應大小的比例設定他們的變化方向及步長。試驗設計及結果見表3，由表3可知，最佳條件為試驗3，因此選取黃豆餅粉40．0 g/L，玉米漿15．0 g/L，碳酸鈣12．0 g/L作為優化試驗的中心點。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果

2．3 中心組合試驗及響應面分析 根據PB和最陡爬坡試驗結果，采用黃豆餅粉40 g/L，玉米漿15 g/L，碳酸鈣12 g/L為中心點，利用Design-Expert響應面分析中的中心組合設計方法(CCD)進行試驗［11］，結果見表 4。

表4 中心組合設計及試驗結果

利用Design-Expert軟件進行二次回歸，得到響應值擬合方程 R1=+28．85+1．40A+1．43B+1．25C －0．15AB －0．28 AC+0．075BC －2．00A2－1．24B2－0．45C2。由此方程進行方差分析，結果表明，建立的回歸模型顯著(P＜0．05)，說明方程擬合度較好;Pr失擬項并不顯著，說明殘差由隨機誤差而引起，模型選擇正確;模型相關系數R2=0．916 6，接近1，表明模型擬合較好，能夠較好地描述該試驗結果。

由回歸方程所作出的響應面立體分析圖(圖1～3)顯示，它們分別反映了黃豆餅粉、玉米漿、碳酸鈣這3個因素之間兩兩交互作用對響應值的影響，通過比較相應曲面的陡峭性狀，可以看出因素A、B、C都隨著量的加大土霉素效價逐步升高，當超過最佳值時，土霉素效價開始下降。

利用軟件Numerical Optimization功能預測響應值最大值時，模型各因素的組合為黃豆餅粉41．0 g/L、玉米漿16．4 g/L、碳酸鈣 12．8 g/L，預測效價為 30．25 mg/L。

圖1 玉米漿和黃豆餅粉對效價的影響

圖2 碳酸鈣和黃豆餅粉對效價的影響

圖3 碳酸鈣和玉米漿對效價的影響

2．4 驗證試驗 為驗證模型預測的準確性，以響應面試驗確定的主要因素最優組合配制培養基進行發酵，重復3次，同時以優化前的原始發酵培養基作為對照。結果顯示，土霉素平均產量由24．34 mg/L上升到29．8 mg/L，與預測結果接近，說明響應面分析得到的最優發酵培養基與預測結果接近。

3 結論與討論

微生物次級代謝產物的產生受到非常復雜的調節，發酵培養基對代謝產物的產量有較大影響，通過改變發酵培養基種類或優化發酵培養基成分，可以提高微生物次級代謝產物的產量。

該研究篩選出影響土霉素產量的3個因素——黃豆餅粉、玉米漿、碳酸鈣，再通過最陡爬坡試驗和CCD試驗進行優化與評價，得到影響土霉素的二次多項式回歸模型，利用統計學方法對該模型進行顯著性檢驗，在含有黃豆餅粉41．0 g/L、玉米漿16．4 g/L、碳酸鈣12．8 g/L培養基成分組成下，土霉素搖瓶產量預測值達30．25 mg/L。經驗證試驗S189菌株經發酵產量可達29．8 mg/L，與理論預測值基本吻合，比優化前提高24．3%，由此可見，應用響應面法進行發酵培養基的優化，提高微生物次級代謝產物的方法是經濟有效、科學合理的。

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