構樹葉中黃酮提取分離工藝的優化

楚芳冰，吳小燕，丁來欣

(1．北京林業大學材料學院，北京 100083;2．北京林業大學理學院，北京 100083)

構樹［Broussonetia papyrifera(L．)Vetn．］原名楮，為灌木類桑科植物，其葉、莖、根、皮、果實均可入藥，在中國歷版藥典中均有收藏［1］。構樹耐瘠薄、干冷、濕熱，根系發達生長迅速，適應于各種類型的土壤，病蟲害少，在我國分布廣、資源豐富。構樹除了有藥用價值外，其果實營養豐富可以做果醋［2］，種子含有大量不飽和脂肪酸，可開發利用［3］;構樹葉亦稱為楮桃葉，蛋白質含量高，經提取純化后能廣泛用于食品加工，但目前只有少量用于豬飼料［4－5］。

構樹葉性甘、涼，治療吐血、外傷出血、水腫、痢疾、癬瘡等［1］，近代藥理研究證明構樹葉具有抗菌抑菌、降血脂、降血壓、抗氧化、抑制腫瘤的作用，可保護肝臟，防治心血管疾病、治療皮膚病等［6－9］。目前，對構樹的化學成分研究發現其中含有大量黃酮類物質，是主要活性成分［10－13］，其中構樹葉中黃酮類物質含量較高，主要有牡荊素、大波斯菊、槲皮素、芹菜素、木犀草素、甘草素等［10－11，14］，極具開發價值。但目前對構樹葉中黃酮物質的提取工藝研究較少［15－16］，對提取物進行純化的工藝研究極少，對構樹葉中黃酮的含量測定結果各不相同［7，17－18］，因此研究有效提取并分離純化構樹葉中的黃酮物質，充分利用這一廉價易得的天然資源，對于開發構樹葉在醫藥和保健品方面的應用有重要意義。該研究采用超聲波輔助溶劑法提取構樹葉中的黃酮，用單因素試驗和正交試驗法優化提取工藝，采用萃取法分離純化提取物，以期為有效地開發利用構樹葉中黃酮提供試驗依據。

1 材料與方法

1．1 材料 構樹［Broussonetia papyrifera(L．)Vetn．］葉，于2013年9月底采于北京市海淀區，在室內自然干燥至恒重后，于冰箱冷凍層保存備用。

1．2 試劑 蘆丁對照品(國藥集團化學試劑有限公司);95%乙醇、石油醚、鹽酸、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，上述試劑均為國產分析純。

1．3 儀器與設備 SPECORD 210PLU8紫外可見分光光度計(德國耶拿);RE-200型旋轉蒸發儀(上海凱美特功能陶瓷公司);KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FA2004B電子天平(上海越平科學儀器有限公司);FW100高速萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

1．4 方法

1．4．1 對照品溶液的制備和標準曲線制作。準確稱取蘆丁對照品0．020 8 g，用60%乙醇完全溶解后轉入100 ml容量瓶中，用60%乙醇定容，配成0．208 mg/ml的蘆丁標準溶液。分別吸取蘆丁標準液 0、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0 ml于 10 ml容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液0．5 ml，放置 6 min后，加入 10%Al(NO3)3溶液 0．5 ml，搖勻后放置 6 min，再加入4%NaOH溶液4 ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻后放置12 min，配制不同濃度的絡合物［18］。以不加蘆丁的溶液做空白，進行紫外可見光譜掃描，確定蘆丁最大吸收波長。在最大吸收波長處分別測定不同濃度蘆丁的吸光度，以吸光度為縱坐標(y)、蘆丁濃度為橫坐標(x)作回歸方程繪制標準曲線。

1．4．2 樣品溶液的制備和黃酮含量的測定。取干燥的構樹葉樣品，用粉碎機粉碎成粉末狀，每次取3 g粉碎的干構樹葉放入錐形瓶中，加入一定質量比的乙醇溶液，采用不同的工藝條件在超聲波清洗器中超聲提取［19］，進行工藝條件選擇，抽濾后得到提取液，用紫外分光光度法測定提取液中黃酮含量［16－17］。每個工藝條件平行做2個樣，最后取結果的平均值。用薄層色譜(TLC)分離鑒定提取液，以蘆丁作為黃酮標準物對照，固定相為硅膠GF254，展開劑為正丁醇∶冰酸酸∶水=4∶1∶1，紫外燈下檢測分離結果，結果作為選擇提取工藝條件以及純化條件的依據之一。

1．4．3 單因素試驗。

1．4．3．1 乙醇濃度對提取黃酮的影響。根據文獻［16］，乙醇對黃酮的提取率較高，所以分別以30%、40%、50%、60%、70%乙醇為溶劑，構樹葉與乙醇的料液比為1∶15(g∶ml)，溫度40℃，超聲提取15 min，抽濾除去濾渣，量取濾液體積，再將濾液離心分離，取 0．3 ml轉入10 ml容量瓶中，按照“1．4．1”的方法加入顯色劑，用 60%乙醇定容，搖勻后在已知最大吸收波長下分別測定黃酮的吸光度。

1．4．3．2 不同提取溫度對提取黃酮的影響。以50%乙醇為溶劑，料液比為 1∶15(g∶ml)，提取溫度分別為 40、50、60、70、80 ℃，提取時間為 15 min，然后按照“1．4．3．1”的方法處理并分別測定吸光度。

1．4．3．3 不同料液比對提取黃酮的影響。以50%乙醇為溶劑，按料液比分別為 1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶30(g∶ml)，提取溫度為40℃，超聲提取時間為15 min。抽濾除去濾渣，濾液再進行離心分離，用50%乙醇分別稀釋濾液至相同體積，混勻后取 0．3 ml轉入 10 ml容量瓶，按照“1．4．3．1”的方法分別測定吸光度。

1．4．3．4 不同提取時間對提取黃酮的影響。以50%乙醇為溶劑，按照料液比為1∶12(g∶ml)，提取溫度為40℃，提取時間分別為 10、25、40、55、70 min，抽濾除去濾渣，后處理及測定步驟同“1．4．3．1”。

1．4．4 正交試驗。根據單因素試驗結果，選取乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度4個因素為主要考察因素，以黃酮提取率作為考察指標，采用L9(34)表進行正交試驗并進行結果分析。

1．4．5 樣品黃酮提取率的計算。根據標準曲線制備項下方法測定得樣品溶液吸光度值，由標準曲線得到樣品溶液質量濃度，按下式計算構樹葉樣品黃酮的提取率:黃酮類化合物提取率(%)=C· V·10－3/W，式中，C為樣品溶液質量濃度(mg/ml);V為樣品溶液體積(ml);W為樣品質量(g)。

1．4．6 樣品的分離純化與工藝流程。根據正交試驗結果，采用最佳提取工藝條件提取干構樹葉中的黃酮，濾液用旋轉蒸發儀回收溶劑，蒸發至原體積的一半左右，將濃縮液用等量石油醚萃取，除去葉綠素和脂溶性雜質，得到水相，在水相中加入6 mol/L的鹽酸處理，使之pH在2左右，然后用等量乙酸乙酯萃取2次［20－21］，分離去水相，將乙酸乙酯相減壓蒸干，得到黃酮提取產物。準確稱取一定量的產物，用60%乙醇溶解，然后用“1．4．1”的方法測定其黃酮含量。提取分離黃酮的工藝流程為:干構樹葉→粉碎→加入乙醇溶劑→超聲提取→抽濾→濾液→回收乙醇→石油醚脫色→水層酸化pH=2→乙酸乙酯萃取2次→回收乙酸乙酯→得到提取產物→測定黃酮含量。

2 結果與分析

2．1 對照品溶液紫外可見光譜掃描和標準曲線制作 由對照品溶液紫外可見光譜掃描得知，最大吸收波長為506 nm。從蘆丁對照品標準曲線(圖1)可看出，回歸方程為y=9．15x+0．007 2(r2=0．996 5)。

2．2 單因素試驗

2．2．1 乙醇濃度對構樹葉黃酮提取率的影響。從圖2可看到，當提取劑乙醇濃度在40% ～50%時提取率較大，隨著乙醇濃度增加，提取率逐步下降。其原因是隨著乙醇濃度增加，脂溶性物質溶出較多，黃酮溶出量下降導致提取率下降，因此選擇40%～50%濃度的乙醇為最佳溶劑。

2．2．2 超聲提取溫度對構樹葉黃酮提取率的影響。由圖3可見，隨著溫度的升高，提取率呈上升趨勢。因為溫度升高加快了分子的擴散能力，從而使構樹葉黃酮的溶出速度增加，提取率升高，在60℃下提取率最大。但溫度進一步提高，可能引起黃酮的分解，導致黃酮提取率下降。因此提取溫度以60℃左右為宜。

2．2．3 料液比對構樹葉黃酮提取率的影響。由圖4可知，隨著提取液比例的增加，構樹葉黃酮提取率也隨之增加。一般情況下，提取液用量越多越利于構樹葉黃酮的溶解，但在1∶20(g∶ml)以后提取率增加速度減緩。過高的料液比也會浪費溶劑和能源。所以選擇最佳的料液比為1∶20～1∶30。

2．2．4 超聲提取時間對構樹葉黃酮提取率的影響。從圖5可看出，隨著超聲時間的增加，構樹葉黃酮的提取率也逐漸增加，當超聲時間為40 min時，構樹葉黃酮提取率達最大，繼續延長超聲時間，構樹葉黃酮提取率呈下降趨勢。可能超聲時間過長，破壞了構樹葉黃酮中的有效成分，因此選取最佳超聲提取時間為40 min。

2．3 正交試驗結果 根據單因素試驗結果設計了各因素水平表(表1)，并建立了L9(34)正交試驗表(表2)。由表2可知，通過極差分析，4個影響超聲波輔助提取構樹葉中黃酮的因素大小順序為D(料液比)＞B(提取時間)＞A(乙醇濃度)＞C(提取溫度)，超聲波提取構樹葉中黃酮的最佳工藝為A2B1C2D3，即乙醇濃度40%、提取時間30 min、提取溫度60℃、料液比為1∶30(g∶ml)，在此條件下，提取率為4．16%。

2．4 樣品的提取分離純化 根據正交試驗結果進行構樹葉中黃酮的提取，用萃取法分離純化提取液。經過試驗證明采用A3B2C1D3的工藝條件提取的黃酮提取液，在后處理步驟能有效地萃取分離黃酮，是最佳提取條件。稱取每份4．00 g干燥粉碎的構樹葉樣品，共6份，按照最佳提取工藝條件，在超聲波清洗機中超聲提取，合并濾液，按照“1．4．6”的方法進行后處理和萃取分離，得到的固體產物質量為1．426 g，產物得率為5．94%。稱取0．261 5 g固體產物，按照“1．4．2”的方法測定黃酮含量，測得固體產物中黃酮的含量為35．36%。

表1 超聲波提取黃酮工藝正交試驗因素和水平表

表2 超聲波提取黃酮正交試驗L9(34)設計及結果

3 結論

該試驗以廉價易得的天然產物構樹葉為原料，采用超聲波輔助乙醇溶劑法提取其中的有效成分黃酮，在單因素試驗基礎上進行正交試驗，得到最佳提取工藝條件。結合分離純化的工藝條件，得出了最優提取純化構樹葉中黃酮的工藝是:以50%乙醇為溶劑，料液比為1∶30(g∶ml)，在50℃下超聲提取40 min，過濾后得到提取液。提取液濃縮至約1/2體積后，用等量石油醚萃取除去葉綠素等脂溶性雜質，用鹽酸酸化水相至pH=2，再用等量乙酸乙酯萃取水相2次，黃酮從水相轉移到乙酸乙酯相，經薄層色譜分離鑒定，乙酸乙酯相中主要成分為黃酮;分離酯層并回收乙酸乙酯，真空干燥得到了黃酮提取物，提取物得率為5．94%，其中黃酮含量達35．36%。

目前尚未見到用超聲波輔助溶劑法從構樹葉中提取黃酮的工藝研究，并用乙酸乙酯萃取提純產物的報道。該工藝可得到含量較高的黃酮提取物，操作簡單、溶劑可回收、提取成本低、提取分離效率高，提取產物可以用其他方法進一步提純。該研究為開發利用構樹葉中的黃酮并使其能應用于醫藥及保健品提供了可靠試驗依據。

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