應用酶聯免疫法快速檢測水產品孔雀石綠殘留

曾 蓉，王明力

(1．貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽 550025;2．貴陽市農產品質量安全監督檢驗測試中心，貴州貴陽 550081)

孔雀石綠(MG)是一種帶有金屬光澤的綠色結晶體，屬三苯甲烷類染料，作為殺真菌劑和消毒劑被廣泛應用在水產養殖上［1］。孔雀石綠被魚體吸收后會代謝為危害更大的隱形孔雀石綠(LMG)和隱形結晶紫(LCV)，并沉積于脂肪組織，經研究發現孔雀石綠具有高毒、高殘留、致畸、致癌、致突變等副作用，殘留時間達到100 d以上，目前許多國家已禁用孔雀石綠。日本、美國、歐盟已不允許其作為獸藥用于水產養殖上。我國在2002年在《動物性食品中獸藥殘留最高限量》(農業部公告235號)中將孔雀石綠列為禁用藥［2］，在動物性食品中不得檢出。但因其價格低廉，在水霉病防治方面尚未有很好的替代品，所以在水產養殖、運輸過程中仍有違規使用，在不同程度上存在禁而不止的現象［3］。

隨著科學技術的發展，檢測水產品中孔雀石綠、結晶紫類物質的手段和方法多種多樣，檢測儀器越來越靈敏。常見方法有國家標準、ELISA試劑盒和膠體金試紙3類。2006年我國頒布了國家標準GB/T20361－2006《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》［4］，該標準方法的準確度較高，但檢測步驟多，樣品前處理繁瑣、費時、檢測成本高，使用有機溶液量大，儀器設備昂貴，不適于對大量樣品進行低成本快速篩選、現場判定的需要。如何采用最快捷、最經濟、最準確的檢驗方法，是食品安全的一項重要研究內容，就目前的發展趨勢看食品安全檢測方法首先要體現快速，因為食品生產者、經營者、監督者都需要準確而又及時的監控結果。鑒于此，筆者選用一種酶聯免疫試劑盒分別對市場抽取43份水產品中孔雀石綠殘留量進行了速測，旨在為水產品安全檢測提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器。電子天平(瑞士梅特勒公司)、離心機(上海安亭儀器廠)、微孔酶標儀(美國寶特公司)、洗板機(美國寶特公司)、旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司)、氮氣吹干裝置(瑞士Buchi公司)、離心管、微量移液器(單道 20～200 μl、100～1 000 μl)。

1．1．2 試劑。乙酸乙酯(分析純)、冰乙酸(分析純)、正己烷(分析純)、孔雀石綠隱性高濃度標準品(2．5 μg/L)、孔雀石綠ELISA檢測試劑盒(力德力諾生物技術有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 樣品制備與提取。水產品樣品去除非食用部分，用勻漿器均質樣品;稱取(1．00±0．05)g勻漿樣品至50 ml離心管中，加入10 ml冰醋酸－乙酸乙酯(1∶99，V/V)溶液，劇烈振蕩2 min;室溫下4 000 r/min離心10 min，取1 ml上層液于離心管中，加入氧化劑液50 μl，輕輕搖勻后室溫避光放置3～5 min;40℃氮氣吹干，吹干后立即加入1 ml樣品稀釋液，再加入1 ml正己烷，渦動20 s混勻，4 000 r/min離心5 min;去除上層有機相，取下層水相50 μl進行檢測。

1．2．2 酶標板操作。取出所需的酶標板孔，在每孔中加入50 μl工作標準品 (0、0．1、0．3、0．9、2．7、27．0 ng/ml)和樣品于所設定的孔中。在每孔中加入50 μl抗體，輕敲微孔板邊緣1 min混勻。25℃避光環境中反應30 min。

洗板4～5次，每次應該加入250 μl 1倍洗液，最后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干。加入100 μl酶標物，輕敲微孔板邊緣混勻，在25℃下避光培養30 min。重復洗板步驟，加入底物A液50 μl，再加底物B液50 μl，輕輕振蕩混勻，25℃下避光反應15～20 min。加入50 μl終止液終止反應，在450 nm波長下測定每孔OD值。

1．2．3 樣品加標回收率試驗。用已檢測的陰性樣品做基體空白，取(1．00 ±0．05)g勻漿樣品，分別加入 0．1 μg/ml孔雀石綠標準溶液 100、300、500 μl，每個濃度2 個平行，采用該試驗方法測定回收率。

2 結果與分析

2．1 孔雀石綠的標準曲線 結果表明，孔雀石綠含量(x，ng/ml)與吸光度之比(y=B/B0，%)的線性方程為:y=－22．889lnx+30．763，R2=0．998 7(圖1)。

表1 不同濃度樣品加標回收率

2．2 樣品中孔雀石綠檢測結果 共檢測樣品43份，其中檢出陽性結果樣品有3份，殘留量分別為2．137、1．581、1．439 μg/kg，檢出率為6．98%。均超過水產品中孔雀石綠限量標準1．000 μg/kg。

2．3 樣品加標回收率 由表1可知，水產品中孔雀石綠的平均回收率為78．27% ～88．73%，表明試驗方法回收率穩定、可靠。

3 討論

樣品檢測如為陰性結果，可直接排除水產品中含有孔雀石綠和隱性孔雀石綠殘留;如為陽性結果，需進一步用高效液相色譜法或液相色譜－串聯質譜確證和定量。該試驗中檢出的3份陽性樣品用高效液相色譜法確認后，均檢出含有孔雀石綠殘留。

ELISA試劑盒的所有試劑需要恢復至20～25℃保證靈敏度，吸附試驗中溶液每次加量要嚴格相同，酶標板洗板時確保干凈，甩干并在吸水紙上吸干后使用。

酶聯免疫快速檢測技術相對傳統和經典的化學檢測和儀器檢測而言，其特點是檢測所需的時間相對較少，對儀器設備、操作人員等條件要求不高，樣品前處理簡單，既快速方便又節約成本，可滿足水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留的篩選以及疑似樣品的確證，應用前景廣闊，有利于政府監管并指導企業自控，促進水產品衛生質量的提高，保護消費者身體健康，提高我國水產品的國際競爭力。

［1］史東杰，孫向軍，梁擁軍，等．水產品中孔雀石綠殘留檢測的ELISA與HPLC 法的比較［J］．現代漁業信息，2009，24(4):11－14．

［2］農業部．中華人民共和國農業部公告第235號:動物性食品中獸藥最高殘留限量［S］．2002．

［3］王麗玲．應用快速檢測試劑盒預測水樣和水產品中孔雀石綠［J］．實用預防醫學，2007，14(6):1900 －1901．

［4］鄭斌，趙紅萍，冷凱良，等．GB/T20361－2006，水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定［S］．北京:中國標準出版社，2006．