雞球蟲的分離與感染試驗

戴銀，沈學懷，張丹俊，趙瑞宏，胡曉苗，侯宏艷，潘孝成，周學利(安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，安徽合肥230031)

雞球蟲病(Chicken coccidiosis)是一種雞常見且危害嚴重的寄生蟲病，經常由一種或多種球蟲聯合引起的急性流行性寄生蟲病［1－2］。不同種類的球蟲在雞腸道內寄生部位有所差異，其致病力也有所不同，其中柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)寄生于盲腸，致病力最強［3］。10～30日齡的雛雞發病率最高，死亡率為20% ～30%，嚴重時可高達80%［4］。感染的雛雞病愈后，生長發育受阻，體重增加緩慢，嚴重影響肉雞飼料轉化率及蛋雞產蛋率。成年雞則一般不發病，但多為帶蟲者，增重和產蛋能力降低，是傳播球蟲病的重要病源之一。該病在全球發病普遍，我國每年也因該病造成巨大的經濟損失。目前，使用抗生素類和化學合成藥物是控制雞球蟲病的主要手段，這些藥物對雞球蟲病的防治起到重要作用，但由于大部分養殖人員沒有科學用藥，再加上我國對抗球蟲藥物使用的監管力度不夠，長期高劑量用藥現象嚴重，導致大量耐藥蟲株的出現，使得一些抗球蟲治效果降低甚至失效，因此對雞球蟲病防治工作越發困難［5－7］。筆者分離并培養較為常見且危害嚴重的雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊，研究卵囊發育和感染的過程，以期為探索長期有效的雞球蟲病防控方法打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 安徽省某家禽養殖場具有典型感染球蟲病雞的糞便。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑。飽和食鹽水、生理鹽水、2.5%重鉻酸鉀溶液。

1.2.2 儀器。燒杯、計數板、載玻片、蓋玻片、培養皿、玻璃棒、60目銅篩、離心管、低速離心機、恒溫培養箱、電子天平、電子顯微鏡、烘箱。

1.3 球蟲卵囊的分離與培養 從安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所的養殖基地取感染球蟲病雞的糞便置于干凈的燒杯中，加入少量蒸餾水用玻璃棒搗碎混勻，再加入5倍體積的蒸餾水攪拌均勻，用60目篩網過濾，重復水洗糞便2～3次，棄去殘渣。將濾液置于離心管中，4 00 0r/min離心6 min，棄去上清液。在沉淀中加入5倍體積的飽和食鹽水，攪拌混勻，裝入離心管中，4000 r/min離心6 min，取上清液置于干凈燒杯中，棄沉淀。用蒸餾水6倍稀釋上清，稀釋后置于離心管中，4 000 r/min離心6 min，棄上清液，重復水洗2次，洗去卵囊沉淀中的鹽分，加入2.5%的重鉻酸鉀溶液，置于培養皿中混勻，28℃條件下培養。

1.4 球蟲卵囊的觀察 將培養18、24、36、48 h后的球蟲卵囊置于顯微鏡下觀察并記錄其形態、顏色、大小和數量變化。當有80%以上的卵囊發育為孢子化卵囊時停止培養，收集卵囊，于4℃下保存備用。

1.5 球蟲卵囊的接種 將30只15日齡的健康肉雛雞隨機分成感染組和空白對照組，早晨空腹逐只稱重，記錄并計算初始平均體重，各組試驗雞在相同條件下進行飼養，空白對照組進行單獨隔離飼養，以防污染。感染處理組每只雞接種約1×105個卵囊，接種后每天觀察并記錄各組雞的臨床表現(如采食、飲水、行為、羽毛的光澤度、精神狀態，血便和發病死亡情況等)，試驗結束后解剖發病雞，記錄發病部位和發病程度。

2 結果與分析

2.1 卵囊的形態變化 混勻培養溶液，用移液槍吸取少量的液體滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，在電鏡下觀察。從圖1可以看出，分離到的球蟲卵囊大多形態飽滿，為寬橢圓形，少數為卵圓形，壁光滑，中間明顯可見1個圓形的核，原生質呈淡褐色，卵囊大小約為18.5 ～25.5 μm ×16.7 ～22.5 μm。正常的孢子化卵囊多能見到分化明顯的4個形狀規則的孢子，試驗發現18 h即可看到部分卵囊孢子化，約占總數的13%;24、36、48 h分別有33%、80%和95%的卵囊孢子化。

2.2 接種雞的臨床表現 接種后每天觀察并記錄2組雞的臨床表現，感染組第3天有個別雞狀態不佳，第4天感染組部分雛雞不同程度表現出采食量減少、食欲不佳、精神萎靡沉郁、羽毛蓬亂、翅膀下垂等臨床癥狀，嚴重則出現離群呆立，縮頸閉眼，甚至食欲廢絕等癥狀，繼而出現拉稀或者血便等現象。第5天陸續出現6例因感染球蟲而致死的死亡病例。然而，健康對照組雛雞則精神、食欲、飲欲和糞便均表現正常。

2.3 血便、死亡和體重變化 未接種卵囊的雛雞整個試驗過程中均較健康，未出現血便和死亡現象。接種卵囊的雛雞第4天開始出現血便，占全部糞便的50%，第6天出現大量血便，占達80%左右，第7天血便量則有所下降(表1)。由表2可知，接種雛雞第5天死亡2只，第6天死亡3只，第7和8天則各死亡1只，到試驗結束時存活率僅為53.3%。未接種和接種雛雞試驗結束時平均凈增重差異明顯，分別為76.7和9.3g，接種雞相對增重僅為12.1%(表3)。此外，試驗第8天逐只解剖接種雞，發現病雞盲腸壁增厚，病變明顯，嚴重者盲腸腫大，充滿大量血液。

表1 雛雞的血便情況

表2 雛雞的死亡情況

表3 雛雞體重的變化

3 討論

近年來，隨著規?；B殖的發展，球蟲病的危害日趨嚴重。雞球蟲分布廣、危害性大，種類較多，世界各國已經記載的約有14種，我國已發現的至少7種［8－9］。傳統的形態學方法是球蟲種類鑒定常用的方法，該方法準確性高，可應用于雞球蟲的鑒定［10］。雞球蟲不同種類寄生部位和致病性均有差異，其中柔嫩艾美耳球蟲致病性最強，是危害最嚴重的一個種。柔嫩艾美耳球蟲寄生于盲腸，臨床上出現明顯的血便，這種特征有助于純種的分離鑒定。該研究分離的雞球蟲球蟲卵囊形態飽滿，多為寬橢圓形，卵囊大小約為18.5～25.5 μm ×16.7 ～22.5 μm，孢子化卵囊多能見到分化明顯的4個形狀規則的孢子;此外，接種的發病雛雞，體重增加緩慢，血便明顯，死亡率較高，同時解剖可見盲腸明顯病變，且腸壁增厚，嚴重者因充滿大量血液而盲腸腫大。根據卵囊的形態、大小，發病雞的臨床特征，卵囊寄生部位和盲腸病理變化等特征，以及已有文獻的報道［9，11－12］，初步判斷該試驗分離到的球蟲主要為柔嫩艾美耳球蟲。目前，控制球蟲病的手段主要還是抗球蟲藥物，由于抗生素和化學藥物的長期不規范使用導致球蟲產生了耐藥性，藥物使用年限不斷縮短，造成了巨大的經濟損失。筆者對安徽地區的雞球蟲進行了初步分離和感染試驗，為進一步深入研究雞球蟲的致病和抗藥機制及雞球蟲病預防控制奠定基礎。

［1］林毅，馮澤光.雛雞實驗感染柔嫩艾美爾球蟲的病理學研究［J］.畜牧獸醫學報，1993(5):64－69.

［2］汪明.獸醫寄生蟲學［M］.北京:中國農業出版社，2003:284－288.

［3］索勛，李國清.雞球蟲病學［M］.北京:中國農業大學出版社，1998:238－268.

［4］張浩男，張秀英.常山提取物與西藥聯合用藥對雞球蟲病的療效試驗［J］.東北農業大學學報，2012，43(3):68 －72.

［5］甘德培.抗球蟲藥與球蟲的抗藥性研究進展［J］.中國獸醫寄生蟲病，1999，7(2):53 －56.

［6］張克勤，蔣麗，張俊杰，等.金絲桃素抗雞球蟲效果觀察［J］.湖北農業科學，2012(10):4316－4320.

［7］許金俊，陶建平，彭金彪，等.柔嫩艾美耳球蟲揚州分離株對8種抗球蟲藥的抗藥性［J］.畜牧與獸醫，2008，40(1):18 －21.

［8］FABFICE LAURENT，ROSELYNE MANCASSOLA，SONLA LACROIX，et al.Analysis of Chicken Mucosal Immune Response to Eimeria tenella and Eimeria maxima Infection by Quantitative Reverse Transcription－PCR［J］.Infection and lmmuity，2001，69(4):2527 －2534.

［9］葛凱.雞球蟲的分離鑒定及預防雞球蟲病中草藥復方制劑的研究［D］.合肥:安徽農業大學，2007.

［10］陶建平，符敖齊.柔嫩艾美耳球蟲和巨型艾美球蟲的分離與鑒定［J］.畜牧與獸醫，1997，29(6):248 －249.

［11］苑淑賢，姚新華，任科研，等.柔嫩艾美耳球蟲純種的分離鑒定和致病性觀察［J］.農業與技術，2005，25(4):90 －92.

［12］周克夫，章軍，李雪松，等.柔嫩艾美耳球蟲廈門株(Eimeria tenella)生物學研究［J］.廈門大學學報:自然科學版，2005，44(4):572 －575.