新孢子蟲NcGRA2基因真核表達質粒的構建及其在293細胞內的表達

金春梅，朱慧敏，于龍政，張守發(延邊大學農學院動物醫學系，吉林延吉133002)

新孢子蟲病(Neosporaosis)是由犬新孢子蟲(Neospora caninum)寄生于多種哺乳動物細胞內所引起的一種原蟲病［1］。犬新孢子蟲對懷孕母牛的危害尤為嚴重，可以引起流產，并且通過垂直傳播將蟲體垂直傳播給新生犢牛，給畜牧業造成嚴重的經濟損失［2］。致密顆粒蛋白是一種新孢子蟲排泄－分泌抗原，在刺激機體產生保護性免疫反應中起到重要作用。致密顆粒在蟲體感染宿主細胞后的前期大量分泌，是帶蟲空泡及包囊壁的重要組成成分。其中，NcGRA2是新孢子蟲速殖子表達量較大的一種致密顆粒蛋白，可以有效抵御新孢子蟲速殖子感染［3］。

目前，國內外還沒有找到治療新孢子蟲病的特效藥，主要以預防為主，實行管理上的防疫措施只能在一定程度上減少新孢子蟲的感染，效果往往不顯著，關注較多的還是新孢子蟲疫苗的研究［4］。基于此，筆者利用真核表達載體pcDNA3.1(+)可以在哺乳動物細胞中表達外源基因的特性，構建新孢子蟲NcGRA2基因真核表達質粒，以期將體外表達的蛋白作為免疫原，為進一步研制新孢子蟲核酸疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒與載體 含有NcGRA2基因的質粒pGEX-4T1-NcGRA2由實驗室自制;真核表達載體pcDNA3.1購自Invitrogen公司。

1.2 細胞株與試劑 293細胞和大腸桿菌DH5α感受態細胞，由實驗室保存備用。限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、HindⅢ、DNA Marker、DNA連接酶、DNA純化回收試劑盒均為TaKa-Ra公司產品;新孢子蟲陽性血清由實驗室制備并保存;Alexa 488標記的羊抗鼠IgG抗體購自Molecular Probes公司;脂質體轉染試劑盒ViaFect Transfection Reagent為Promega公司產品。

1.3 NcGRA2基因的真核表達載體的構建 pGEX-4T1-NcGRA2質粒DNA與pcDNA3.1質粒DNA分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收純化，然后用DNA連接酶進行連接。

1.4 重組質的酶切鑒定與序列測定 經藍白斑篩選，挑取白色菌落，提取質粒進行酶切鑒定。將初步鑒定為陽性的重組質粒送至英捷濰基公司進行序列測定。

1.5 真核表達質粒轉染293細胞 將構建的真核表達質粒和真核表達載體pcDNA3.1按照脂質體轉染試劑盒操作說明書中的操作步驟轉染293細胞。

1.6 間接熒光抗體實驗檢測目的蛋白的體外表達 細胞轉染48 h后，用－20℃預冷的甲醇固定10 min，加入一抗(感染新孢子蟲鼠血清1∶200倍稀釋)，37℃孵育2 h，PBS沖洗3次。加入二抗(Alexa 488標記的羊抗鼠IgG抗體1∶4 000倍稀釋)，37℃下孵育1 h，PBS洗滌3次，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 pGEX-4T1-NcGRA2質粒的酶切結果 pGEX-4T1-NcGRA2質粒DNA經EcoRⅠ和XhoⅠ酶切得到2個片段，其中較小的1段在636 bp處(圖1)，這與預期結果相符合。

2.2 重組質粒的酶切鑒定 NcGRA2酶切回收后與pcDNA3.1連接，挑了2個克隆株，用HindⅢ酶對重組質粒進行切鑒定，其中1個克隆株是正確的，得到的279 bp的目的條帶片斷，與預期片斷相符。另外1個克隆株酶切片段與預期片段不符，屬于錯誤連接。

2.3 間接免疫熒光試驗 鑒定為陽性重組質粒用脂質體法轉染至293細胞，經過甲醇固定、一抗和二抗的孵育，在熒光顯微鏡下，可見在細胞表面出現特異熒光(圖3A)，而轉染pcDNA3.1空載體的細胞無熒光(圖3B)。

3 討論

新孢子蟲病能感染多種動物，對牛只威脅嚴重，主要引起母牛流產，目前缺乏有效預防新孢子蟲病的疫苗。新孢子蟲GRA2蛋白具有良好的抗原性［5］。真核表達載體pcDNA3.1包含有CMV高效啟動子，是一種外源基因在哺乳動物細胞內高效表達的良好載體，目前被廣泛應用于DNA疫苗的構建研究［6］。

筆者將新孢子蟲全長GRA2基因克隆至真核表達載體pcDNA3.1中，通過間接熒光抗體試驗驗證試驗所構建的pcDNA3.1-NcGRA2真核表達載體能在體外培養的真核細胞內表達外源蛋白NcGRA2，可為進一步研究抗新孢子蟲病的核酸疫苗提供基礎。

［1］DUBERY J P，CARPENTER J L，SPEER C A，et al.Newly recognize falal protozoan disease of dogs［J］.J Am Vet Med Assoc，1988，192(9):1269-1285.

［2］丁德，于龍政，張守發，等.吉林省部分地區黃牛新孢子蟲病的流行病學調查［J］.畜牧與獸醫，2006，38(11):34-36.

［3］劉群.新孢子蟲病［M］.北京:中國農業大學出版社，2012:85.

［4］張寧，趙博偉，胡曉悅，等.牛新孢子蟲病最新研究進展［J］.上海畜牧獸醫通訊，2012，13(1):10-13.

［5］STROHBUSCH M，MüLLER N，HEMPHILL A，et al.NcGRA2 as a molecular target to assess the parasiticidal activity of toltrazuril against Neospora caninum［J］.Parasitology，2008，135:1065-1073.

［6］茆達干，楊利國，曹少先.影響基因疫苗免疫效果的因素［J］.中國免疫學雜志，2004，20(5):360-366.