紅茶菌和中草藥紅茶菌體外抑制沙門(mén)氏菌的比較研究

蔣小強(qiáng)，邱紅輝，符乃方，蔣盛軍* ，董志超，何際禪，闞 飆，閆梅英，梁未麗(.海南省東方市畜牧獸醫(yī)局，海南東方57600;.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州5777;.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京006)

紅茶菌發(fā)酵液一般是利用紅茶菌母液發(fā)酵茶葉、糖水溶液所發(fā)酵而成的生物活性菌液。由于紅茶菌中含有醋酸菌、酵母和乳酸菌等生物活性菌，再加上茶葉提取物的作用，紅茶菌發(fā)酵菌液一般對(duì)病原細(xì)菌都有較好的抑制作用。研究表明，紅茶菌發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌(Eschrichia coli)、宋內(nèi)志賀氏菌(Shigella sonnei)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等病原細(xì)菌［1－3］，但是該制劑對(duì)酵母菌粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、產(chǎn)阮假絲酵母(Candida utilis)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis(Fres.)Harrison)和霉菌黑根霉(Rhizopus nigricans)、黃曲霉(Aspergillus.flavus)無(wú)抑制作用［4］。

中草藥紅茶菌是在紅茶菌菌培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，利用紅茶菌中草提取液甘草、菊花、羅漢果、啤酒花等中草藥提取液所獲得新型紅茶菌制劑，因?yàn)楹写罅恐胁菟幪崛∫海孕滦图t茶菌制劑被命名為中草藥紅茶菌制劑［5］。研究表明，中草藥紅茶菌制劑對(duì)口蹄疫病毒在體外和體外都有殺滅或抑制作用，對(duì)易感動(dòng)物噴霧中草紅茶菌可以有效預(yù)防口蹄疫的發(fā)生［6－7］。沙門(mén)氏菌是世界上造成食源性食物中毒最多的病原細(xì)菌。我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)也以沙門(mén)氏菌為首位。最近30年，由于人們生活水平的提高以及西餐的飲食方式的引進(jìn)，鮮食蔬菜以及海鮮等水產(chǎn)品越來(lái)越容易導(dǎo)致沙門(mén)氏菌的感染，因此如何預(yù)防沙門(mén)氏菌的感染成為我國(guó)日常流行性細(xì)菌疾病預(yù)防與控制的重要研究課題之一。沙門(mén)氏菌的最適培養(yǎng)pH為6.5～7.5，屬于喜歡偏中性以及弱堿性的病原菌。因此，能夠產(chǎn)生大量有機(jī)酸以及耐酸性強(qiáng)的益生菌都能有效抑制或拮抗沙門(mén)氏菌。紅茶菌包含自然界產(chǎn)酸性最強(qiáng)的醋酸菌，因此紅茶菌能夠有效抑制沙門(mén)氏菌［8－10］。為了研究紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌特性，筆者以沙門(mén)氏標(biāo)準(zhǔn)菌和臨床分離沙門(mén)氏菌菌株為材料，研究紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌效果，旨在為臨床上預(yù)防沙門(mén)氏菌的感染提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試中草藥紅茶菌制劑與菌種 紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑為實(shí)驗(yàn)室自制［5－7］。鼠傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株LT2(Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)［11］以及 20 個(gè)沙門(mén)氏菌臨床分離株(Salmonella Typhi，編號(hào)分別為:4371、4373、42、1396、4369、1607、1449、4368、1220、1395、79、353、198、4367、1301、4374、1601、245、781、1430)。這些菌種都由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所腹瀉病室鑒定、保存和提供。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑。沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基為法國(guó)科瑪嘉沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基，購(gòu)自鄭州博賽科技有限責(zé)任公司;MH肉湯、紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑均為實(shí)驗(yàn)室自制［5－7］。紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑使用一次性微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾滅菌。

1.2.2 主要儀器。微量加液器、電子天平、37℃培養(yǎng)箱、振蕩器。

1.3 方法

1.3.1 鼠傷寒沙門(mén)氏菌細(xì)菌培養(yǎng)。鼠傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株LT2(Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)［11］以及 20個(gè)沙門(mén)氏菌臨床分離株(Salmonella Typhi，編號(hào)分別為4371、4373、42、1396、4369、1607、1449、、4368，1220、1395、79、353、198、4367、1301、4374、1601、245、781、1430)分別接種到法國(guó)科瑪嘉沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基，然后挑單菌落接種到5 ml肉湯培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 致病菌懸液的制備。將肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株LT2(Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)以及10個(gè)沙門(mén)氏菌臨床分離株(Salmonella Typhi，編號(hào)分別為 4367、79、13、4374、4371、1091、1220、1396、4369、4373)分別置于生理鹽水管中，充分混勻，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫?約1×108cfu/ml)和5.0麥?zhǔn)蠞岫?1×109cfu/ml)。

1.3.3 試管稀釋法測(cè)定微生態(tài)制劑對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制濃度。每排放置6只2 ml的離心管，除每排第1支離心管外，每只離心管內(nèi)加已高壓滅菌的MH肉湯1 ml，每排的第1、2管分別加入2 ml受試物，依次對(duì)倍稀釋至第7管，此時(shí)試管內(nèi)紅茶菌制劑或中草藥紅茶菌制劑濃度依次為1∶1、1∶2、1∶4和1∶8，第6管作為測(cè)試菌生長(zhǎng)質(zhì)控，然后每管加入3.6 μl 0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊臏y(cè)試菌液，使用振蕩器混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)12 h后，取出1環(huán)接種沙門(mén)氏顯色平板培養(yǎng)基，根據(jù)是否有病原菌生長(zhǎng)來(lái)確定微生態(tài)制劑對(duì)測(cè)試菌的抑菌濃度.

1.3.4 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅茶菌和中草藥紅茶菌體外抑制沙門(mén)氏菌的影響。每排安排5只2 ml的離心管，每只離心管內(nèi)加1 ml紅茶菌原液、紅茶菌稀釋液、中草藥紅茶菌原液和稀釋液，然后每管加入3.6 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊臏y(cè)試菌液，用振蕩器混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)1、2、4、8和12 h后，每小時(shí)取出1環(huán)接種沙門(mén)氏顯色平板培養(yǎng)基，根據(jù)是否有病原菌生長(zhǎng)來(lái)確定共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)微生態(tài)制劑抑菌效果的影響。

1.3.5 紅茶菌和中草藥紅茶菌原液對(duì)接種大劑量、高濃度沙門(mén)氏菌的體外抑制作用。為了探索通過(guò)口服紅茶菌和中草藥紅茶菌預(yù)防沙門(mén)氏菌感染的可能性，每排安排6只2 ml的離心管，每只離心管內(nèi)加入1 ml紅茶菌原液、中草藥紅茶菌原液，然后每管加入20、50、125、250、500 和1 000 ml 5.0 麥?zhǔn)蠞岫鹊臏y(cè)試菌液，用振蕩器混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)12 h后，取出1環(huán)接種沙門(mén)氏顯色平板培養(yǎng)基，根據(jù)是否有病原菌生長(zhǎng)來(lái)確定微生態(tài)制劑的抑菌效果。

1.3.6 紅茶菌原液和中草藥紅茶菌原液對(duì)接種大劑量、高濃度臨床沙門(mén)氏菌的體外抑制作用。為了探索通過(guò)口服紅茶菌和中草藥紅茶菌預(yù)防沙門(mén)氏菌感染的可能性，每排安排20只2 ml的離心管，每只離心管內(nèi)加入1 ml紅茶菌原液、中草藥紅茶菌原液，然后每管分別加入20個(gè)沙門(mén)氏菌臨床菌株200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊臏y(cè)試菌液，用振蕩器混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)12 h后，取出1環(huán)接種沙門(mén)氏顯色平板培養(yǎng)基，根據(jù)是否有病原菌生長(zhǎng)來(lái)確定微生態(tài)制劑的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)濾滅菌的中草藥紅茶菌對(duì)接種低濃度沙門(mén)氏菌的體外抑制作用 由表1可知，1 ml過(guò)濾紅茶菌菌液，接種3.6 μl麥?zhǔn)蠞岫?.50沙門(mén)氏標(biāo)準(zhǔn)株LT2菌液，培養(yǎng)12 h后只有過(guò)濾的紅茶菌原液無(wú)沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)，其余處理包括對(duì)照大多有沙門(mén)氏菌生長(zhǎng);過(guò)濾的中草藥紅茶菌制劑的原液以及1∶1稀釋的菌液能夠完全抑制所接種的沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)，1∶2稀釋的過(guò)濾滅菌中草藥紅茶菌制劑的原液雖然不能完全抑制所接種的沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)。這表明過(guò)濾滅菌的中草藥紅茶菌制劑原液以及1∶1倍稀釋液都能夠完全抑制所接種的低濃度的沙門(mén)氏菌，其余稀釋液濃度不能完全殺滅低濃度的沙門(mén)氏菌;與紅茶菌相比，過(guò)濾滅菌的中草藥紅茶菌的抑菌效果顯著強(qiáng)于紅茶菌。

表1 過(guò)濾滅菌紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)接種低濃度沙門(mén)氏菌的體外抑制作用

2.2 過(guò)濾滅菌紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)接種高濃度沙門(mén)氏菌的體外抑制作用 由表2可知，1 ml過(guò)濾滅菌的紅茶菌菌液，接種3.6 μl(麥?zhǔn)蠞岫?5.0)，培養(yǎng) 12 h 后只有過(guò)濾的原液中無(wú)沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)，其余處理包括對(duì)照大多有沙門(mén)氏菌生長(zhǎng);過(guò)濾滅菌的中草藥紅茶菌制劑的原液以及1∶1稀釋的菌液能夠抑制沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)。這表明過(guò)濾滅菌的紅茶菌制劑只有原液能夠殺滅大量的高濃度的沙門(mén)氏菌，其余稀釋液不能完全殺滅大量的高濃度的沙門(mén)氏菌。與過(guò)濾滅菌的紅茶菌菌液相比，過(guò)濾滅菌的中草藥紅茶菌的抑菌效果顯著強(qiáng)于紅茶菌液。

表2 過(guò)濾滅菌紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)接種高濃度沙門(mén)氏菌的體外抑制作用

2.3 紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)接種低濃度沙門(mén)氏菌的體外抑制作用 由表3可知，紅茶菌原液和稀釋菌液，接種3.6 μl(麥?zhǔn)蠞岫?.50)，培養(yǎng)12 h后只有過(guò)濾的原液無(wú)沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)，其余處理包括對(duì)照多有沙門(mén)氏菌生長(zhǎng);中草藥紅茶菌制劑的原液以及1∶1稀釋的菌液能夠抑制沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)。這表明紅茶菌只有原液能夠殺滅大量的低濃度沙門(mén)氏菌，其余稀釋液不能完全殺滅低濃度的沙門(mén)氏菌;與紅茶菌相比，中草藥紅茶菌的抑菌效果顯著強(qiáng)于紅茶菌。

表3 紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)接種低濃度沙門(mén)氏菌的體外抑制作用

2.4 紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)接種高濃度沙門(mén)氏菌的體外抑制作用 由表4可知，1 ml紅茶菌接種3.6 μl(麥?zhǔn)蠞岫?.0)沙門(mén)氏菌，培養(yǎng)12 h后只有紅茶菌原液無(wú)沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)，其余處理包括對(duì)照多有沙門(mén)氏菌生長(zhǎng);中草藥紅茶菌原液以及1∶1稀釋的菌液能夠抑制沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)。這表明紅茶菌制劑只有原液能夠殺滅大量的高濃度的沙門(mén)氏菌，其余稀釋液不能完全殺滅大量的高濃度的沙門(mén)氏菌;與紅茶菌相比，中草藥紅茶菌的抑菌效果更強(qiáng)一些。

表4 紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)接種高濃度沙門(mén)氏菌的體外抑制作用

2.5 紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)接種大劑量、高濃度沙門(mén)氏菌的體外抑制作用 在上述研究的基礎(chǔ)上，為了探索通過(guò)口服紅茶菌和中草藥紅茶菌預(yù)防沙門(mén)氏菌感染的可能性，在紅茶菌菌液乳酸菌制劑的原液中接種大劑量、高濃度鼠沙門(mén)氏菌LT2，觀察乳酸菌制劑的原液對(duì)這些大劑量、高濃度的沙門(mén)氏菌的的體外拮抗作用。由表5可知，1 ml紅茶菌原液最大可以拮抗250 μl高濃度的沙門(mén)氏菌(麥?zhǔn)蠞岫?.0);1 ml中草藥紅茶菌原液最大可以拮抗1 000 μl高濃度的沙門(mén)氏菌，中草藥紅茶菌明顯比紅茶菌具有更強(qiáng)的抑制沙門(mén)氏菌的作用效果。

表5 紅茶菌與中草藥紅茶菌原液對(duì)接種大劑量、高濃度沙門(mén)氏菌的體外拮抗作用

2.6 紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)臨床分離沙門(mén)氏菌的抑制效果 為了進(jìn)一步探索紅茶菌和中草藥紅茶菌是不是對(duì)醫(yī)院臨床分離的沙門(mén)氏菌菌株有拮抗作用以及預(yù)防效果，利用從醫(yī)院分離的20株臨床沙門(mén)氏分離菌株為材料，培養(yǎng)這些菌液后將200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木航臃N到紅茶菌和中草藥紅茶菌制劑原液中。由表6可知，1 ml紅茶菌菌液僅對(duì)臨床分離的3個(gè)菌種 245、781、1430的200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木壕哂型耆囊种谱饔茫瑢?duì)其余的13個(gè)臨床菌株菌液200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木簺](méi)有完全的抑制作用;中草藥紅茶菌制劑的原液對(duì)這20個(gè)臨床分離菌種200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木涸壕哂型耆囊种谱饔谩＿@表明一些臨床分離的沙門(mén)氏菌拮抗紅茶菌和中草藥紅茶菌抑制作用的能力顯著強(qiáng)于沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)株LT2。但是，由于中草藥紅茶菌具有顯著的抑菌作用，1 ml中草藥紅茶菌能完全抑制所有這20個(gè)臨床分離沙門(mén)氏菌200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木骸?/p>

表6 紅茶菌對(duì)不同沙門(mén)氏桿菌菌株拮抗效果的比較

3 討論

沙門(mén)氏菌是一種發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家都普通流行的一種腹瀉病原細(xì)菌。它也是一種人畜共患致病病菌。沙門(mén)氏菌感染可以引起人和動(dòng)物的傷寒、副傷寒、胃腸炎和敗血癥等疾病，因此沙門(mén)氏菌的傳染和爆發(fā)對(duì)人和動(dòng)物的危害很大［12］。沙門(mén)氏菌為腸桿菌科沙門(mén)氏菌屬成員，有約2 500多種血清型。通過(guò)使用沙門(mén)氏菌疫苗來(lái)預(yù)防眾多血清型的病原菌難度很大。利用益生菌來(lái)預(yù)防沙門(mén)氏菌是其中最好的選擇之一，乳酸菌、芽孢桿菌等益生菌都用于預(yù)防沙門(mén)氏菌的感染。雖然效果不錯(cuò)，但是在很多情況下這種效果又不顯著，從而增加推廣和應(yīng)用的難度。此外，這些都是產(chǎn)酸性偏弱的益生菌。因此，如何預(yù)防沙門(mén)氏菌的感染在發(fā)達(dá)國(guó)家都是一個(gè)重要的難題。

該研究結(jié)果表明，1 ml紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑都可以殺滅或抑制250 μl或1 000 μl高濃度的沙門(mén)氏菌。由于中草藥紅茶菌抑制沙門(mén)氏菌的能力約比紅茶菌菌液強(qiáng)近4倍。

沙門(mén)氏菌是一種通過(guò)口服傳染的病原體。對(duì)于身體虛弱的群體，少量的沙門(mén)氏菌感染(如15～20個(gè)菌)即可發(fā)病;成人的致病菌量需高達(dá)104～1010個(gè)以上。1 ml紅茶菌制劑可以殺滅250×109cfu，相當(dāng)于高致病劑量的2.5×106～25.0×106倍感染劑量;1 ml中草藥紅茶菌制劑預(yù)計(jì)可以殺滅1.0×1012個(gè)沙門(mén)氏菌，相當(dāng)高致病劑量的1×107～1×109倍感染劑量。如此推理，口服200 ml紅茶菌，200 ml紅茶菌制劑可以殺滅4×1011個(gè)沙門(mén)氏菌，相當(dāng)于400倍正常情況的感染劑量，相當(dāng)于低感染劑量情況下4×109～4×1011倍感染劑量;同理，口服200 ml中草藥紅茶菌，200 ml中草藥紅茶菌制劑可以殺滅8×1011個(gè)沙門(mén)氏菌，相當(dāng)于800倍正常情況的感染劑量，相當(dāng)于特殊情況下8×109～8×1011倍感染劑量。因此，如果每次在食用高風(fēng)險(xiǎn)含沙門(mén)氏菌的海鮮或食品，口服200 ml紅茶菌或中草藥紅茶菌菌液都能很好地預(yù)防沙門(mén)氏菌的感染。

為了控制由食用雞蛋而導(dǎo)致的沙門(mén)氏菌食物中毒，我國(guó)食品專家利用我國(guó)的有關(guān)資料與信息建立了帶殼鮮雞蛋沙門(mén)氏菌定量危險(xiǎn)性評(píng)估模型，對(duì)我國(guó)帶殼鮮雞蛋的沙門(mén)氏菌污染情況進(jìn)行定量評(píng)估:消費(fèi)前每個(gè)污染雞蛋中的沙門(mén)氏菌菌量平均70 CFU［13］。通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)方法的改進(jìn)，對(duì)采自皖南山區(qū)的80枚土雞蛋樣品進(jìn)行了沙門(mén)氏菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋黃沙門(mén)氏菌感染率為2.5%，蛋清沙門(mén)氏菌感染率為5.0%。蛋殼表面沙門(mén)氏菌感染率為27.5%，沙門(mén)氏菌帶菌數(shù)為1.22×103［14］。根據(jù)上述雞蛋的帶菌量，每次口服200 ml中草藥紅茶菌是可以殺滅這些沙門(mén)氏菌的。由此可見(jiàn)，雞蛋中帶有的沙門(mén)氏菌是一個(gè)很大的疾病感染源。由于我國(guó)很少有食用生雞蛋的習(xí)慣，因此在食用雞蛋導(dǎo)致的感染比較少見(jiàn)。然而，在美國(guó)等有食用生雞蛋的國(guó)家，雞蛋感染的沙門(mén)氏菌是一個(gè)很重要的致病菌來(lái)源。2010年美國(guó)發(fā)生由于雞蛋沙門(mén)氏菌導(dǎo)致的人體感染，沙門(mén)氏菌爆發(fā)已經(jīng)導(dǎo)致逾1 000人發(fā)病，召回被疑感染沙門(mén)氏菌雞蛋的數(shù)量超過(guò)5億枚。在澳大利亞，沙門(mén)氏菌平均每年導(dǎo)致11 992例感染［15］。一般而言，國(guó)外雞蛋的沙門(mén)氏菌帶菌量比國(guó)內(nèi)的略少或相差不多，因此食用生雞蛋的情況下，每次飲用100～200 ml中草藥紅茶菌菌液就可以殺滅這些病原菌，從而減少沙門(mén)氏菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。

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