抗寒丹參機理及物質基礎研究

鐘 燦，宋 瀟，周海燕，謝昭明*(.湖南省中醫藥研究院，湖南長沙4003;.湖南省中醫藥高等專科學校，湖南株洲40)

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根莖，為多年生草本植物［1］，為大宗常用中藥材，有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩等功用，對許多疾病均有治療作用，特別是對心腦血管病具有很好的臨床療效。

丹參對土壤氣候適應性強，適宜種植在土層深厚、排水良好、中等肥力的砂壤土中，粘土和鹽堿地不宜生長。性喜溫暖濕潤、陽光充足的環境，耐寒、耐旱。李倩等對商洛6個地區丹參的研究表明，無霜期與年極端最高溫度是影響丹參素含量的主導因子，7月均溫、年均溫度、年極端最高溫度是影響丹參酮IIA含量的主導因子［2］。劉紅云通過大田試驗、盆栽試驗等研究不同生長因子和環境因子對丹參生長和活性成分積累的影響，從而建立丹參生長模擬模型指導丹參生產，以期獲得高產、優質的丹參藥材［3］。舒志明等研究指出春季地溫10℃時開始返青，溫度20～26℃、相對濕度80%時生長旺盛，秋季氣溫降至10℃以下時，地上部分開始枯萎，根在-15℃的情況下，可安全越冬［4］。該研究從河南省三門峽市盧氏縣引種的丹參，產量高。經過多年發現栽培極少數一部分丹參0℃以下長達30多天不倒苗，經篩選、移栽作為抗寒丹參，冬季倒苗的稱為普通丹參。在此以抗寒丹參和普通丹參為材料，通過研究其形態、葉片和根莖的抗氧化酶活性和可溶性多糖含量的差異，探討抗寒丹參的抗寒機理并對其進行選育，對培育出具有優良抗寒能力的丹參良種具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2013年11月20日和2013年12月15日，在湖南省望城區銅官鎮丹參栽培基地隨機分別采挖兩年生抗寒丹參和普通丹參植株，取其葉片和根莖進行抗氧化酶活性和可溶性糖含量的測定。

1.2 測定指標

1.2.1 抗氧化酶活性測定。隨機取抗旱丹參和普通丹參葉片和根及根莖測定其抗氧化酶活性，其中用KMnO4標準溶液滴定法測過氧化氫酶(CAT)活性、愈創木酚法測POD活性、NBT還原法測SOD活性和考馬斯亮藍(G-250)法測可溶性蛋白質含量［5］。SOD活性以抑制氮藍四唑NBT光氧化還原50%的酶量為1個活力單位u，CAT活性以1 min每毫克蛋白質酶解1 μmol H2O2為1個活力單位u，POD活性以1 min每毫克蛋白質催化的470 nm下OD值變化為一個酶活單位 u［5］。

1.2.2 可溶性糖含量測定。

1.2.2.1 試驗材料。隨機取抗寒丹參和普通丹參葉片于80℃烘箱中烘干，粉碎，過80目篩，備用。

1.2.2.2 對照品溶液的制備。取經105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品41.3 mg，精密稱定，置100 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.2.3 供試品制備。取丹參葉粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取50 ml水，稱重，超聲1 h，冷卻，補足損失水量，過濾，取續濾液，即得。

1.2.2.4 樣品含量測定。分別精密吸取供試液0.3 ml于25 ml具塞試管中，加水至2.5 ml，加入5.0%苯酚水溶液6.0 ml，在冰水浴中緩緩加入濃硫酸至刻度，搖勻，放冷后置沸水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，放冷至室溫，隨行溶劑空白，于489 nm測定吸收度。

1.3 數據處理 采用Excel對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 抗寒丹參與普通丹參外觀形態比較 通過多年丹參栽培發現極少數一部分丹參冬季不倒苗，將其稱為抗寒丹參。普通丹參幼苗最抗寒，播種發芽后2個月左右不怕冰凍、嚴寒，半年內抗寒能力比抗寒丹參還強，一年以上老苗抗寒能力差，普通丹參中抗寒丹參植株僅有1% ～2%能夠經受2～3場雪，將抗寒丹參于保鮮膜內裝好，放置冰柜內-3℃ 4 d以上，顏色沒有變化，仍然鮮活、不失綠，表明篩選出來的丹參抗寒能力強，能長期抵抗-3℃的低溫和寒冬。

抗寒丹參與普通丹參在形態上有較大的差別，抗寒丹參基生葉多，葉密集，葉片大，不斷萌發新葉片，老葉呈墨綠色，新葉片呈新綠色，葉厚實，色濃綠，多皺折，凹凸不平，海綿組織、柵欄組織發達，寒冬、低溫不枯萎、變黃，無明顯老葉，莖較矮，莖生葉少，根外皮呈褐色，纖維較多。普通丹參基生葉較少，葉較稀疏，葉片較小，葉薄，色綠、黃綠、淺綠，皺折較少，較平坦，海綿組織、柵欄組織較發達，生長中期有明顯老葉，莖高，莖生葉多，寒冬、低溫一段時間后，地上部分枯萎、變黃，葉片從外至內依次變黃直至枯萎，整個地上部分枯萎、變黃，第二年春季才開始萌發，根呈紫紅色，纖維較少。

2.2 丹參不同部位抗氧化酶活性比較研究

2.2.1 不同丹參根及根莖抗氧化酶活性的比較。從表1可以看出，抗寒丹參和普通丹參根及根莖在經歷了一段時間的低溫后，其根及根莖內的保護酶活性有差異，抗寒丹參根及根莖內POD、CAT保護酶活性明顯高于普通丹參，而SOD酶活性則略低于普通丹參。由此可見，當丹參的根莖受到寒冷時，抗寒丹參為了維持其地上部分的生長所需的水分和礦質養分，其根莖種抗氧化酶活性升高以保護其免受冷害、凍害威脅，寒冷季節能夠正常生長。

表1 不同丹參根莖酶活性測定的比較

2.2.2 不同丹參葉片抗氧化酶活性的比較。從表2可以看出，抗寒丹參和普通丹參經過一段時間的低溫后，抗寒丹參葉片內的SOD、CAT酶活性顯著高于普通丹參葉片，而POD酶活性則兩者相差甚微，研究結果表明植物酶活性與植物抗寒性具有一定的關系。

表2 不同丹參葉片抗氧化酶活性的比較

2.3 不同丹參葉片可溶性糖含量的比較 可溶性糖以及與之共存的可溶性物質，如甘氨酸甜菜堿、脯氨酸在寒冷保護中的作用已被廣泛報道。植物學研究中一直把擬南芥作為模式植物，研究各種條件下植物的生理生態變化，Strand等就利用轉基因擬南芥研究發現擬南芥中蔗糖磷酸合酶的超表達可促進蔗糖水平的提高，同時可以在一定程度上提高植株的耐寒性［6］。通過紫外分光光度計法，用葡萄糖作為標準品，測定抗寒丹參葉片和普通丹參葉片內可溶性糖的含量，結果發現，抗寒丹參葉片內的可溶性糖含量為3.55%，普通丹參葉片內可溶性糖的含量為2.02%，兩者差異十分明顯。

3 小結與討論

試驗結果表明，抗寒丹參與普通丹參不僅在外觀形態上存在差異，其植株內的抗氧化酶活性和可溶糖含量也存在差異。抗寒丹參葉片濃綠、厚實、基生葉密集，根及根莖表皮褐色，多纖維;而普通丹參的葉片翠綠、稍薄、葉片稀疏，根及根莖表皮紫紅色，肉質少纖維。植物葉片形態與抗寒性有很大關聯，抗寒植物海綿組織、柵欄組織發達，排列緊密，葉綠素多，細胞質濃，內含物多，抗寒植物除激素、酶活性水平較高外，還有其物質結構和代謝物質基礎作為保證。有報道稱培育小麥壯苗壯蘗可以提高其抗寒能力［7］，但未見利用某種具體模式植物研究其形態結構與抗寒性的關系。

Scebba等研究表明植物遇低溫會積累大量對膜和膜相關的生物大分子有害的活性氧(AOS)，而低溫馴化可使植物體內抗氧化物酶系統加強，從而提高植物對活性氧的耐受力［8］。該研究發現，抗寒丹參葉片的保護酶活性均高于普通丹參，其中SOD和CAT酶活性有顯著性差異;抗寒丹參根莖中POD和CAT酶活性顯著高于普通丹參根莖，而SOD酶活性略低于普通丹參根莖。抗寒丹參葉片中可溶性糖含量明顯高于普通丹參，與可溶性糖對植物冷害能起到一定保護作用的文獻報道結果相一致［9］。

綜上所述，抗寒丹參和普通丹參在形態和生理上存在差異，當抗寒丹參受到冷害、凍害時，其葉片中SOD、CAT酶以及可溶性糖含量升高，當抗寒丹參根及根莖受到冷害、凍害時，根莖中的POD和CAT含量升高，抗寒丹參有其形態、生理、抗氧化酶活性、可溶性糖含量等作為其抗寒的物質基礎。

［1］余世春，琚小龍，段廣勛.丹參的化學成分和藥理活性研究概況［J］.安徽衛生職業技術學院學報，2002(2):43-47.

［2］李倩，梁宗鎖，董娟娥，等.丹參品質與主導氣候因子的灰色關聯度分析［J］.生態學報，2010，30(10):2569-2575.

［3］劉紅云.丹參生長模擬模型及活性成分積累的調控研究［D］.楊凌:西北農林科技大學，2011.

［4］舒志明，梁宗鎖，衛新榮，等.丹參GAP規范化栽培技術［J］.陜西農業科學，2004(6):9-10.

［5］李玲.植物生理學模塊試驗指導［M］.北京:科學技術出版社，2009.

［6］STRAND ?，FOYER C H，GUSTAFSSON P，et al.Altering flux through the sucrose biosynthesis pathway in transgenic Arabidopsis thaliana modifies photosynthetic acclimation at low temperatures and the development of freezing tolerance［J］.Plant，Cell and Environment，2003，26:523-536.

［7］孫學成，譚啟玲，胡承孝，等.低溫脅迫下鉬對冬小麥抗氧化酶活性的影響［J］.中國農業科學，2006，39(5):952-959.

［8］SCEBBA F，SEBUSTIANI L，VITAGLIANO C.Changes in activity of antioxidant enzymes in wheat(Triticum aestivum L.)seedlings under cold acclimation［J］.Physiology of Plant，1998，104:747-752.

［9］王紅星，古紅梅，周琳，等.不同生長時期葉片中可溶性糖含量與抗寒性關系［J］.周口師范學院學報，2003，20(5):51-52.