生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選·鑒定及其目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

徐 鑫，劉 婭，楊 麗 (石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003)

生物表面活性劑(Biosurfactants，簡(jiǎn)稱BS)是微生物等通過(guò)生物發(fā)酵，產(chǎn)生的具有親水基與憎水基的有機(jī)大分子化合物［1］。生物表面活性劑的結(jié)構(gòu)相對(duì)于化學(xué)表面活性劑的種類與結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。生物表面活性劑一般分為五大類，包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂以及中類脂衍生物等［2］。由于生物表面活性劑具有很多功能特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品、食品工業(yè)、石油工業(yè)和生物環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域［3－4］。相對(duì)于化學(xué)合成的表面活性劑，生物表面活性劑在食品行業(yè)中有著尤為突出的優(yōu)勢(shì)。由于生物表面活性劑對(duì)于食品具有無(wú)毒或低毒、容易被生物降解、附著控制與阻止微生物大量滋生等優(yōu)點(diǎn)［5－6］，近年來(lái)，在食品行業(yè)中對(duì)生物表面活性劑的研究日益增多。因此，生物表面活性劑在食品行業(yè)中具有深遠(yuǎn)廣闊的應(yīng)用前景［7］。

筆者運(yùn)用油平板法、排油圈法［8］等方法對(duì)從葡萄中篩選出的72株菌株進(jìn)行初篩與復(fù)篩，初步篩選出產(chǎn)生物表面活性劑的最佳菌株，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，通過(guò)酸沉降與有機(jī)萃取法提取粗產(chǎn)物，并通過(guò)薄層層析試驗(yàn)、紅外光譜分析等鑒定生物表面活性劑類型，為研究脂肽類生物表面活性劑的產(chǎn)生與應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種。由筆者課題組從葡萄中分離篩選獲得，共72株，包括細(xì)菌、酵母菌和霉菌。

1.1.2 培養(yǎng)基。油平板培養(yǎng)基:硫酸銨10.0 g/L;磷酸氫二鉀4.5 g/L;磷酸二氫鉀3.5 g/L;硫酸鎂1.0 g/L;氯化鈉1.5 g/L;氯化鉀1.5 g/L;瓊脂粉 15.0 g/L;V(液體石蠟)∶V(橄欖油)=1∶11.5;pH 7。

菌種保藏培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g/L;瓊脂20.0 g/L;氯化鈉4.0 g/L;瓊脂 20.0 g/L;pH 7。

種子培養(yǎng)基:氯化鈉4.0 g/L;蛋白胨10.0 g/L;牛肉膏3.0 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基:機(jī)油 20.0 g/L;硫酸銨3.0 g/L;硫酸鎂0.5 g/L;磷酸氫二鈉4.0 g/L;氯化鈉 4.0 g/L;磷酸二氫鉀 4.0 g/L;pH 7。

1.1.3 主要儀器設(shè)備。SVY-CF-1F超凈工作臺(tái)，KBF720恒溫恒濕培養(yǎng)箱，5810R型高速冷凍離心機(jī)，MLS-3750高壓滅菌鍋，F(xiàn)A1004電子天平，Genex Beta移液槍，MOTIC B SERIES生物顯微鏡，IRPrestige-21日本島津紅外光譜儀。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)生物表面活性劑菌株的初步篩選。通過(guò)培養(yǎng)將分離后得到的72株葡萄內(nèi)生菌菌株接種于油平板表面，然后放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察每株待測(cè)菌株菌的擴(kuò)油圈的生成。只有產(chǎn)出生物表面活性劑的菌株能夠乳化油脂類物質(zhì)才在吸收橄欖油的條件下形成較為明顯的擴(kuò)油圈，故后續(xù)研究應(yīng)選擇在培養(yǎng)皿表面具有相對(duì)明顯擴(kuò)油圈的菌落。

1.2.2 產(chǎn)生物表面活性劑菌株的復(fù)篩。將C2J6發(fā)酵液置于離心機(jī)中條件為8 000 r/min離心20 min，抽取上清液。加14 ml蒸餾水于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，并向水面滴加1 ml橄欖油經(jīng)蘇丹Ⅲ染色形成油膜。在穩(wěn)定油膜中心滴加300 μl發(fā)酵上清液，待液面穩(wěn)定并且發(fā)酵液將油圈液面由中心擴(kuò)至圓形后測(cè)其直徑即排油圈直徑，并分別測(cè)其表面張力，選取排油圈直徑最大與表面張力數(shù)值最小的菌株作鑒定研究。

1.2.3 菌株的鑒定。

1.2.3.1 菌株的形態(tài)觀察。將葡萄內(nèi)生菌菌株C2J6接種于28℃恒溫牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放置3 d后通過(guò)顯微鏡觀察C2J6菌落形態(tài)。

1.2.3.2 26S rDNA 的擴(kuò)增與測(cè)序。采用26S rDNA對(duì)篩選出的C2J6菌株進(jìn)行分子鑒定。稀釋涂布法將菌接種于PDA平板上，28℃過(guò)夜培養(yǎng)。DNA的提取方法按照文獻(xiàn)引物序列:上游引物為5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';下游引物為5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s后，57℃退火45 s，72℃延伸時(shí)長(zhǎng)1 min，在35個(gè)循環(huán)后;72℃再延伸10 min時(shí)長(zhǎng)。PCR反應(yīng)體系為50 μl。經(jīng)過(guò)EB染色、用紫外凝膠成像儀進(jìn)行分析1%瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物，并送由外部檢測(cè)，測(cè)定方為上海市美吉生物工程有限公司。

1.2.4 生物表面活性劑的初步鑒定。

1.2.4.1 生物表面活性劑的粗提薄層層析檢測(cè)。將發(fā)酵液放置于離心機(jī)中在8 000 r/min離心30 min去除菌液當(dāng)中的微生物菌體與雜質(zhì)。將收集到的C2J6培養(yǎng)上清液用6 mol/L濃HCl調(diào)至pH 2.0，放置于4℃冰箱靜置12 h，將過(guò)夜菌液放置于離心機(jī)8 000 r/min離心30 min收集沉淀。再用pH 2.0的HCl洗滌一次，隨后滴加1 mol/L NaOH溶液于該沉淀中，穩(wěn)定后使最終pH為7.0，冷凍干燥10 h，得到含有一定量雜質(zhì)的固體表面活性劑粗品。將提取物放置到硅膠板上再用氯仿－乙酸溶劑展開(kāi)，在高溫與密封條件下鹽酸水解后與茚三酮反應(yīng)，在高溫下顯色。

1.2.4.2 生物表面活性劑的提純及紅外掃描。將“1.2.4.1”步提取出的生物表面活性劑粗品用體積比為2∶1的氯仿－甲醇混合液進(jìn)行萃取試驗(yàn)，放置于冷凍干燥機(jī)中，干燥過(guò)后即得生物表面活性劑樣品。取定量生物表面活性劑樣品進(jìn)行紅外測(cè)定。

1.2.4.3 生物表面活性劑帶電性能的檢測(cè)。采用亞甲基藍(lán)－氯仿測(cè)定法與溴酚藍(lán)測(cè)定法測(cè)定其生物表面活性物質(zhì)帶電性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩與復(fù)篩 通過(guò)初篩得到9株明顯產(chǎn)出生物表面活性劑的菌種，并對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。試驗(yàn)顯示，菌株C2J6產(chǎn)生的排油圈直徑最大。由此，可以判斷菌種C2J6產(chǎn)生表面活性劑的能力相對(duì)強(qiáng)力。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)特征。如圖1所示，C2J6在油平板培養(yǎng)基上菌落呈圓形態(tài)，黑色沙粒狀孢子由中心向邊緣由密集到逐漸稀疏，邊緣為乳白色緊密且較為短小的絨毛狀菌絲。在顯微形態(tài)下為無(wú)色半透明狀的無(wú)隔菌絲，較為多次的分枝，且分枝頂端較為膨大，無(wú)假根，上顯小梗，孢囊梗直立，圓形孢子呈現(xiàn)熟鏈狀分布，表象為一串“分生孢子”。

2.2.2 C2J6 PCR擴(kuò)增與菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立。對(duì)C2J6進(jìn)行26S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(120 V 20 min)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。C2J6菌株26S rDNA的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果于NCBI上進(jìn)行同源性分析，對(duì)C2J6進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3，發(fā)現(xiàn)與黑曲霉有100%的同源性，確定其分類地位為黑曲霉菌株(Aspergillus niger)。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)出生物表面活性劑的薄層層析 對(duì)C2J6菌株產(chǎn)出的生物表面活性劑粗樣品進(jìn)行薄層層析分析，結(jié)果如圖4。由圖4可見(jiàn)，在0.5%的無(wú)水丙酮茚三酮溶液呈現(xiàn)出紫紅色印記，表明黑曲霉C2J6菌株培養(yǎng)產(chǎn)生的生物表面活性物質(zhì)為脂肽類。

2.4 紅外光譜分析 菌株C2J6的干燥樣品經(jīng)KBr壓片法做紅外檢測(cè)測(cè)定。由圖5可見(jiàn)，在 FT-IR光譜圖上，樣品位于3 450～3 250 cm－1范圍有一較為明顯的寬吸收峰，且最強(qiáng)吸收峰值為3 354 cm－1。通過(guò)查詢可得樣品分子具有N－H和C－H鍵的伸縮振動(dòng)，則該生物表面活性劑含有氨基碳?xì)浠衔铩Ｎ挥? 629 cm－1與1 544 cm－1譜帶為2個(gè)酰胺鍵特征譜帶，則該樣品中含有肽鍵物質(zhì)，表明該樣品肽鏈為親水基。在1 720 cm－1顯示有一個(gè)C=O的伸縮振動(dòng)峰，而2 926～2 823 cm－1和1 427～1 350 cm－1的伸縮振動(dòng)峰為脂肪碳鏈中的C－H鍵，表明脂肪酸鏈為該生物表面活性劑分子的疏水基部分，為憎水端。因此，菌株C2J6發(fā)酵得到的為脂肽類生物表面活性劑。

2.5 C2J6發(fā)酵產(chǎn)物帶電性能的檢測(cè) 檢測(cè)C2J6發(fā)酵產(chǎn)物帶電性，根據(jù)對(duì)陰、陽(yáng)離子生物表面活性劑測(cè)定，發(fā)現(xiàn)陰離子氯仿檢測(cè)層變?yōu)樗{(lán)色，而陽(yáng)離子檢測(cè)未發(fā)生顏色改變，表明該產(chǎn)物是陰離子生物表面活性劑。

3 結(jié)論

該研究從新疆釀酒葡萄分離出的72株菌株中篩選并分離得到1株性能良好的產(chǎn)生物表面活性劑菌株C2J6。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和26S rDNA同源性分析初步鑒定，菌株C2J6為黑曲霉菌株(Aspergillus niger)。經(jīng)薄層層析與紅外分析鑒定，C2J6菌株發(fā)酵液產(chǎn)物為脂肽類表面活性劑，其帶電性能為陰離子型。該研究結(jié)果為產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑擴(kuò)充了葡萄內(nèi)生菌C2J6菌種，為脂肽類生物表面活性劑在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了較為有力的理論基礎(chǔ)。后續(xù)研究將更加著重于對(duì)該生物表面活性劑的適應(yīng)環(huán)境與應(yīng)用特點(diǎn)，并有望大力推進(jìn)脂肽類生物表面活性劑研究的內(nèi)容與應(yīng)用展望。

［1］YOUSSEF N H，DUNCAN K E，NAGLE D P，et al.Comparison of methods to detect biosurfactant productionby diverse microorgaisms［J］.Journal of Microbiological Methods，2004，56(3):339 －347.

［2］NITSCHKEA M，COSTA S G V A O.Biosurfactants in food industry［J］.Trends in Food Science ＆ Technology，2007，18:252 －259.

［3］LEE S C，LEE S J，KIM S H.Characterization of new biosurfactant produced by Klebsiella sp.Y6-1 isolated from waste soybean oil［J］.Bioresource Technology，2008，99(7):2288 －2292.

［4］張?zhí)靹?生物表面活性劑及其應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:218－363.

［5］向智男，寧正祥.生物表面活性劑及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.糧油食品科技，2005，13(1):50 －52.

［6］LUKONDEH T，ASHBOLH N J，ROGERS P L.Evaluation of Kluyveromyces marxianus FII 510700 grown on a lactose-based medium as a source of natural bioemulsifier［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2003，30:715 －720.

［7］侯占群，高彥祥.生物表面活性劑及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2010(4):170－174.

［8］YOUSSEF N H，DUNEAN K E，NAGLE D P.Comparison of methods to deteet biosurfactant produetion by diverse mieroorganisms［J］.Joumal of Microbiologieal Methods，2004，56:339 －347.