北沙參不定根誘導及懸浮培養研究

苗曉燕，王 琳 (保定學院生化系，河北保定071000)

北沙參(Radix Glehniae)，又名海沙參、野沙參、羊乳根等，為傘形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis Fr.Schmidtex Miq)的根，為沙參屬多年生草本植物，山東、河北、內蒙、遼寧為其主產區。其嫩莖葉均可入蔬，其根為著名的中藥材，與人參、玄參、丹參、黨參并稱為五參。研究表明，北沙參的主要活性成分有歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、補骨質素等14種香豆素，還有一種香豆素苷元、多糖、生物堿及揮發油等。藥理學研究和臨床實踐表明香豆素類成分是主要的有效成分，具有止咳化痰［1］、抗突變［2］、抗菌［3］、抗腫瘤［4］和鎮痛鎮靜［5］等作用。

目前，利用生物技術進行重要資源繁殖并大規模生產其有效成分已成為一條新的發展途徑。其中根培養可以使次生代謝產物的合成能力明顯提高［6］。近年來，國內外通過培養不定根生產有用次生代謝產物的研究日益活躍，此技術已在人參［7－9］、白術［10］、甘草［11］等植物中獲得成功。筆者擬采用不同途徑獲得北沙參不定根，進而探究NAA、IBA及蔗糖對其不定根增殖的影響，以期為后續利用生物反應器大量擴繁北沙參不定根提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 北沙參，采集于安國藥材種植基地。

1.2 儀器與設備 低速大容量離心機(上海安亭科學儀器廠)、電子天平(LP303型，常熟市衡器廠)、全溫振蕩器(中國哈爾濱東聯電子技術開發公司)、超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)

1.3 方法

1.3.1 北沙參不定根誘導。取新生北沙參的的葉片和莖段為外植體，自來水沖洗10 min，移至超凈工作臺，用70%乙醇泡20 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞消毒8 min，無菌水洗滌3次，無菌濾紙吸干。

方法1:用解剖刀切成1 cm左右莖段，接種于B5+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L 蔗糖培養基中，pH 5.8，溫度(25±1)℃，暗培養。

方法2:用解剖刀將葉片表面劃傷，接種于B5+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L 蔗糖培養基中，pH 5.8，溫度(25±1)℃，暗培養。

方法3:取一定量保定學院生化系細胞生物學實驗室誘導的愈傷組織［12］，轉接至 MS 液體培養基中，pH 5.8，(25 ±1)℃，110 r/min振蕩培養20 d。

1.3.2 蔗糖濃度對北沙參不定根生長的影響。將不定根剪成0.5～1.0 cm的小段，分別接種于含不同濃度蔗糖(10、20、30、40、50 g/L)的MS 液體培養基中，轉速110 r/min，溫度(25±1)℃，振蕩培養21 d收獲。

1.3.3 IBA濃度對北沙參不定根生長的影響。將不定根剪成0.5 ～1.0 cm 的小段，分別接種于含不同濃度 IBA(1、2、3、4、5、6 mg/L)的MS(上述適宜濃度蔗糖)液體培養基中，轉速110 r/min，溫度(25±1)℃，振蕩培養21 d收獲。

1.3.4 NAA濃度對北沙參不定根生長的影響。將北沙參不定根剪成0.5～1.0 cm的小段，分別接種于含不同濃度NAA(0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mg/L)的 MS+IBA(上述適宜濃度)+蔗糖(上述適宜濃度)液體培養基中，轉速110 r/min，溫度(25±1)℃，振蕩培養21 d收獲。

1.3.5 北沙參不定根生長曲線的測定。將北沙參不定根接種至100 ml MS培養基中(含上述篩選出的合適濃度IBA、蔗糖和NAA)，置于搖床(25℃，110 r/min)中振蕩培養。分別在第0、3、6、9、12、15、18、21 天隨機取出3 瓶，測定其生長量。

1.3.6 北沙參生物量的測定。將培養至21 d的不定根取出，濾紙吸干水分，稱重即為濕重;50℃烘干后，再稱重即為干重。

2 結果與分析

2.1 不同途徑誘導北沙參不定根情況 由圖1可知，3種不同途徑均可誘導出不定根，但從誘導出的不定根狀態來看，葉片和莖段誘導出的根較纖細，數量較少。而由愈傷組織誘導出的不定根粗壯，細長，乳白色，且生長速度快。因此，愈傷組織誘導不定根作為獲得北沙參不定根是較簡單和理想的途徑。

2.2 不同濃度蔗糖對北沙參不定根生長的影響 研究發現，當蔗糖濃度較低時，根的生長速度緩慢，分支少，隨著蔗糖濃度的增加，不僅鮮重和干重呈加速上升的趨勢，且根的顏色呈白色，分支增多。由圖2可知，濃度為40 g/L的不定根鮮物重(4.48 g)和干物重(0.54 g)達到最大值，之后生長量呈較穩定的趨勢，說明較低濃度的蔗糖溶液不利于不定根的生長，適當增加濃度可加速不定根的生長，但濃度過高則又會抑制其生長，這可能與高濃度蔗糖導致細胞內滲透壓過高有關［13］。因此較適合不定根生長的蔗糖濃度為40 g/L。

2.3 不同濃度IBA對北沙參不定根生長的影響 分別考察了1、2、3、4、5、6 mg/L 共6 個濃度 IBA 對北沙參不定根增殖的影響。由圖3可知，隨IBA濃度升高，北沙參不定根的鮮物重和干物重均呈增加趨勢，當IBA濃度達到4 mg/L時，鮮物重(5.93 g)和干物重(0.69 g)均達到最大值，此時北沙參不定根生長狀態最好，新長出來的不定根新鮮，根系粗壯，顏色乳白，生長旺盛。當IBA濃度繼續增加時，培養的不定根顏色逐漸變為褐色，部分開始死亡，且鮮重和干重均呈逐漸下降趨勢。說明過高濃度的IBA對北沙參不定根的生長具有一定的抑制作用。

2.4 不同濃度NAA對北沙參不定根生長的影響 由圖4可知，當用0.8 mg/L NAA處理北沙參不定根時，其生長狀態最好，鮮物重(7.44 g)和干物重(0.75 g)均達到最大值。且發現，隨著NAA濃度的提高，北沙參不定根會發生輕微的愈傷化，即在根的周圍出現透明隆起，且培養基中出現一定的小細胞團。因此，綜合考慮北沙參不定根的生長狀態及生物量，發現0.8 mg/L NAA較適合北沙參不定根的生長。

2.5 北沙參不定根生長曲線 分別在不定根生長的不同天數(0、3、6、9、12、15、18、21 d)進行取樣測定其生長量，結果見圖5。由圖5可知，北沙參不定根的生長曲線呈近S型，0～3 d為延滯期，3～12 d不定根快速生長，進入對數生長期，12 d后趨于平穩，生物量略有下降。說明隨著北沙參不定根的生長，營養物質逐漸被消耗，當不能滿足根的生長時，根將逐漸出現褐化的現象。

3 結論與討論

該試驗采用3種途徑進行北沙參不定根的誘導，結果表明，利用愈傷組織在MS培養基中能較快速地獲得不定根。隨后又考察了IBA、NAA和蔗糖3種因素對北沙參不定根生長的影響，發現當蔗糖濃度為40g/L、IBA濃度為4mg/L、NAA濃度為0.8 mg/L時，較有利于不定根的生長，可明顯提高其生物量，這說明適宜比例的NAA和IBA組合對植物不定根的形成和生長具有一定的促進作用。這將為后續利用生物反應器大規模生產北沙參不定根獲取重要代謝產物——香豆素奠定基礎。

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