DAPI染色法在流式細胞術中檢測BHK-21細胞周期的探討

俞宗佑，楊孝樸(．甘肅農業大學動物醫學院，甘肅蘭州730070;2．中農威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州730046)

細胞周期分析對反映一個細胞群體的增殖活性具有重要意義，利用流式細胞術進行DNA含量測定是細胞周期分析的重要手段，目前仍然是廣泛使用的方法之一。應用細胞流式技術進行細胞周期檢測，其結果不僅受樣品固有性、樣品的處理方法及熒光染色的影響，而且受分析方法的影響。目前，用于檢測細胞周期的染料種類較多，其中碘化丙啶(PI)是常用染料，但嵌入到雙鏈DNA和RNA的堿基對中與之結合，無堿基特異性，因此染色前必須用核糖核酸酶A處理細胞，排除雙鏈 RNA 的干擾［1－2］。4，6-聯脒-2 苯基吲哚(DAPI)是DNA特異性的熒光染料，與DNA結合是非嵌入式的，主要結合在A－T堿基區，使用時無需用RnaseA處理細胞，但由于配置紫外激光源的流式細胞儀非常昂貴，大多數實驗室都沒有配備。因此，利用DAPI標記DNA分析細胞周期的方法尚未成為常規檢測方法被普遍采納，也沒有簡單的標準實驗流程可供參考［3－4］。筆者采用 DAPI標記BHK-21細胞，探索簡便易行的DNA檢測技術，檢測細胞周期中各期的DNA含量，以及時預測規?；囵B細胞培養細胞增殖活性的情況，為規?；毎囵B的檢測奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 儀器及試劑 NucleoCounter NC-3000自動化全光譜定量細胞成像分析儀、DAPI試劑盒，均為Chemometec公司產品;細胞計數儀，為INNOVATIS產品;懸浮培養細胞BHK-21，為中農威特生物科技股份有限公司馴化并保存。

1．2 樣品的制備 將生長狀態良好的BHK-21細胞進行傳代批式培養。取生長狀態良好的細胞，以4×105個/ml的密度接種于含200 ml培養基的細胞培養三角瓶中，于37℃條件下150 r/min培養。培養過程中，分別在24、48、60 h對細胞取樣，并進行細胞形態觀察，檢測細胞濃度和細胞活力。將樣品用PBS沖洗2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用冰凍的70%無水乙醇固定，置于4℃條件下備用。

1．3 染色與上機檢測 將處理好的細胞樣品，每份懸浮于0．5 ml DAPI染色液中，37℃避光染色5 min，取適量染色后的細胞樣加入到NC-Slide A8的檢測室中，將上樣后的NCSlide A8放置于NC3000主機的托盤中，進行上機檢測。

2 結果與分析

2．1 細胞形態 在顯微鏡下觀察細胞形態發現，大多數細胞散在分布，單個細胞透亮，邊緣光滑，形態長良好。

2．2 細胞生長濃度與活性 在起始濃度為4×105個/ml，經過一段時間培養，0～48 h內細胞密度逐漸呈上升趨勢，48 h后繼續培養，細胞濃度逐漸呈下降趨勢(圖1);細胞活性先有所增加，達到最大值后呈下降趨勢，直至細胞大部分死亡(圖2)。

2．3 細胞周期分析 將DAPI染色后的BHK-21細胞上機進行檢測，經NC-3000系統對細胞進行細胞周期分析，結果表明，48 h以前S期和G2/M期的DNA含量總數呈上升趨勢，大部分細胞逐進入DNA合成期;培養48 h后，S期和G2/M期的DNA含量總數明顯呈下降趨勢(圖3)。

3 討論

細胞濃度與細胞活力都是監測細胞質量好壞的重要指標［5］。該試驗細胞周期檢測結果表明，在細胞培養到48 h，細胞S期和G2/M期含量逐漸呈上升趨勢，并達到最高值，同時這一培養時間內細胞密度也達到最大值，且細胞活力高達95%以上，二者的檢測結果相一致。該試驗結果表明細胞培養開始階段，培養液中營養豐富，細胞在較低密度下生長，代謝活躍，大部分處在G0/G1期，為下一階段DNA合成S期貯備足夠營養物質和能量，隨著培養時間的延長，細胞逐漸向DNA合成期過渡，完成DNA合成，最后進入G2/M，細胞開始分裂增殖。該試驗中細胞生長到72 h，大部分細胞被阻滯在G0/G1期，此期細胞明顯增多，細胞不能在增殖，表明隨著培養時間的延長，細胞培養液中營養物質大量被消耗，同時細胞代謝產生大量副產物，這些因素都嚴重影響細胞的生長［6－7］。因此，檢測細胞周期可預測下一個階段細胞生長趨勢與增殖情況，為規膜化細胞培養提共理論參考。

細胞周期染色方法很多，筆者探討了DAPI標記BHK-21細胞，結果表明DAPI是一種可靠的DNA檢測方法，并且其樣本制備更簡單、易行。這種染料可作為帶紫外激光器的分選儀上檢測DNA的最佳選擇。雖然PI的DNA染色效果好，適用于普通流式細胞儀上檢測(488 nm激發)，但由于其具有毒性，污染后不易清除且不能標記活體細胞等局限性，因此，不適用于在分選儀上檢測［8－9］。

筆者借助NC-3000自動化全光譜定量細胞成像分析儀所建立的DAPI染色法簡單易行，不必加通透劑，也不分離核，是一種適用于多參數分析的檢測細胞DNA含量的方法，而且實驗流程更簡單、快速，可作為具備紫外激光器的流式細胞儀上首選的DNA熒光染料。能夠準確檢測細胞周期，為規模化細胞培養過程中監控細胞生長狀態提供一種良好的檢測方法。

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