百合組培球莖尖剝取技術研究

孫明偉，趙統利，邵小斌，朱朋波，湯雪燕，劉興滿 (連云港市農業科學院，江蘇連云港222006)

百合病毒病是當前制約百合生產中最主要的病害之一，嚴重制約了百合產業的發展。隨著我國百合進口量、種植面積的增加，以及不規范種植和種球自繁，病毒病在我國各百合種植區發生流行，一般發病率在40% ～50%，二代球的帶毒率在90%以上［1］，嚴重影響了切花百合的產量和質量。現食用百合種植區的帶毒率幾乎為100%，成為我國栽培百合種群衰退的重要因素［2］。

目前百合所攜帶的病毒及植原體約有21種［3］，其中發生普遍、危害嚴重的病毒主要有百合無癥病毒(Lily symptomless virus，LSV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，cmV)和百合斑駁病毒(Lily mottle virus，LMoV)等。自1962年Phillips利用莖尖培養成功脫除百合病毒后，莖尖培養被廣泛應用于百合無毒種球生產過程的研究越來越多，目前關于百合莖尖脫毒的報道，大多集中在對商品球莖尖大小的剝離及綜合處理方法研究［4－5］，雖然能有效脫除百合病毒，但存在所需脫毒材料較多、污染率高、技術難度操作較大等問題，大多停留在實驗室階段。但對百合組培球莖尖剝離的難易程度及大小卻鮮有報道。

筆者通過對不同直徑組培球莖尖的剝離來尋求適合百合最佳剝離的組培球及莖尖，以期獲得操作簡單、污染率低、易剝離的百合組培球，以期為百合種球化生產提供必要的技術支撐。

1 材料與方法

1．1 材料 從連云港市東辛農場實驗基地，于2013年8月12日采集具有明顯病毒病癥狀的木門、索邦百合植株，取其表面完好無病斑的鱗片洗凈，經0．1%升汞消毒后，放置于MS+6%蔗糖+7．0 g/L瓊脂+1 mg/L IBA暗培養120 d以上(每隔30～60 d繼代1次)，形成不同直徑大小的百合組培球備用。

1．2 試驗方法

1．2．1 不同大小的組培球對百合剝取莖尖的影響。將不同直徑大小的百合組培球按 0 ～0．5、0．5 ～1．0、＞1．0 cm 3 個規格分別剝離百合組培球莖尖。在10～80倍的解剖鏡下，觀察2 h內剝離組培球的莖尖(大小為0．5～0．8 mm)數量，挑取莖尖的難易程度及完整性;把剝離的百合莖尖放置在百合培養基上(MS+3%蔗糖+7 mg/L瓊脂+2 mg/L 6-BA+0．2 mg/L NAA)，暗培養120 d后，統計莖尖的成活率及脫毒率。

1．2．2 不同大小的莖尖對百合脫毒效果的影響。取直徑小于0．5 cm的百合組培球，在10～80倍的解剖鏡下，剝離不同大小的莖尖;把剝離的百合莖尖放置在百合培養基上(MS+3%蔗糖+7 mg/L瓊脂+1 mg/L 6-BA+0．2 mg/L NAA)，經過30 d的暗培養，觀察莖尖的污染率、成活率;150 d后對形成的百合組培小球進行脫毒檢驗，并進行統計分析。

1．3 統計方法 采用 Duncan檢驗進行顯著性比較，采用DPS 2．0和Excel 2003軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2．1 不同大小的組培球對百合剝取莖尖的影響

2．1．1 剝離莖尖的速度。由表1可知，木門、索邦2個品種的組培球，在同一直徑內剝離莖尖的數量差異不明顯;但在2 h的單位時間段內，不同直徑的組培球，剝離莖尖的數量差異顯著，其中直徑0．5～1．0 cm的組培球剝離莖尖的數量最多:木門27．18個/2 h、索邦28．38 個/2 h;其次是直徑小于0．5 cm的木門、索邦品種，分別為22．18個/2 h和21．56個/2 h;2 h內剝離莖尖數量最少的是直徑大于1．0 cm的木門、索邦組培球，分別為15．19/2 h和15．02個/2 h。方差分析表明，組培球莖尖剝離速度在品種間沒有差異，但百合組培直徑大小間在0．05和0．01水平上均表現差異顯著，說明百合組培球直徑大小嚴重影響百合剝取莖尖的速度。

表1 2 h內剝離莖尖的數量

2．1．2 莖尖的完整性及挑取莖尖的難易程度。由表2可知，百合組培球在莖尖剝離的過程中，莖尖完整性的百分比在其品種間基本無差異，但在不同直徑大小的組培球之間有一定差異，其中直徑大于0．5 cm的組培球剝離的莖尖均差異不顯著，但直徑大于0．5 cm與小于0．5 cm之間剝取的莖尖完整性百分比在0．05和0．01水平上均表現顯著性差異。

由表2可知，木門、索邦2個品種均在直徑大于0．5 cm的組培球表現出一般容易挑取，而小于0．5 cm的組培球在挑取莖尖的過程中均表現較難，說明大于0．5 cm的組培球更容易獲得較完整的莖尖進行培養。

表2 剝離莖尖的完整性及挑取莖尖的難易程度

2．1．3 莖尖的成活率。由表3可知，百合組培球剝取的莖尖在不同品種間差異較小，但在不同組培球的直徑間有一定差異，其中直徑大于0．5 cm與小于0．5 cm的組培球其剝取的百合莖尖，其成活率在0．05和0．01水平上表現顯著性差異，而大于0．5 cm的組培球其剝取的莖尖在培養過程中其成活率在0．05和0．01水平上均無顯著差異。

表3 剝離莖尖的成活率

2．2 不同大小的莖尖對百合脫毒效果的影響 從表4可以看出，隨著莖尖的減小，其污染率均有所增加，當剝離的莖尖小于0．4 mm時，其污染率達到15%，而當莖尖大于0．7 mm時，污染率不到10%，說明百合在剝離莖尖的過程中，其剝離的莖尖越小污染率越高，可能是在百合剝離莖尖的過程中，莖尖剝離的越小，操作時間越長，操作越復雜污染的機會越大。

剝離的不同大小的百合莖尖放在培養基上，經過30 d的培養，有些莖尖逐漸褐化死亡，由表4可知，百合莖尖在培養過程中均有不同程度的死亡，其中小于0．4 mm的莖尖，成活率最低達到30%;最高的是大于1．0 mm的百合莖尖，其成活率達到98%。

存活的莖尖經過180 d后的培養繼代長成組培球，抽取單個莖尖長成的組培球進行病毒檢測。由表4可知，莖尖大小與百合脫毒率成反比關系，即莖尖越大其脫毒率越低，當剝離的莖尖小于0．4 mm時，脫毒率達到67%，而大于1．0 mm時只有15%。

表4 莖尖大小對其成活率的影響

3 結論與討論

百合組培球剝取莖尖，不僅克服了百合剝取莖尖過程中消毒困難的環節，同時節省了操作時間和降低了操作難度。該研究對2個品種(木門、索邦)的組培球進行系統的莖尖剝取技術研究，結果表明，剝取莖尖的速度、質量及難易程度均有較大差異;而在同樣條件下的組培球剝取不同大小的莖尖過程中，不同莖尖的大小在培養基及操作過程中的污染率、成活率及脫毒效果均有不同差異。

3．1 百合組培球大小對剝取莖尖的影響 莖尖培養脫毒技術是目前最廣泛、最重要的一個途徑［6］。從該試驗結果來看，直徑小于0．5 cm的組培球，雖然單位時間內可以剝取較多的莖尖，但由于剝取莖尖的完整性及成活率較低，且不易挑取，故不適合莖尖剝離;直徑大于0．5 cm的百合組培球，較適合百合剝取莖尖，其中直徑在0．5～1．0 cm的組培球剝取莖尖速度快、質量完整，且成活率高，最適合莖尖的剝取。

3．2 不同大小的莖尖對百合脫毒效果的影響 在植物莖尖脫毒過程中，剝取的莖尖越小其脫毒效果越好，但其培養的成活率越低［7］，這與該研究的結果一致。雖然小于0．4 mm的莖尖脫毒率最高達到56%，但莖尖小于0．4 mm的百合莖尖成活率只有30%，顯然不能滿足百合種球生產的需求;0．4～0．7 mm的莖尖雖然脫毒率比小于0．4 mm的莖尖脫毒率低，達到61%，但成活率較高，其污染率也在可控范圍之內，故適合百合種球生產的需求。

該研究表明，單純利用莖尖剝取技術很難完全脫去百合病毒，這與王超等［8］的研究結果一致，要取得較好的脫毒效果必須與其他脫毒方法結合使用。

［1］ZHENG H Y，CHEN J，ZHAO M F，et al．Occurrence and sequences of Lily mottle virus and Lily symptomless virus in plants grown from imported bulbs in Zhejiang province，China［J］．Arch Virol，2003，148:2419 －2428。

［2］明軍，徐榕雪，穆鼎，等．百合病毒及其脫毒研究進展［M］//張啟翔．中國觀賞園藝研究進展．北京:中國林業出版社，2006:504－511．

［3］劉文洪．百合病毒的分子鑒定與重要病毒的檢側研究［D］．杭州:浙江大學，2003

［4］鐘海豐，黃宇翔，鄧朝生，等．東方百合快繁培養基優化與脫毒技術研究［J］．中國農學通報，2009，25(17):168 －173．

［5］周曉波，吳藝飛，丁茁荑．卷丹百合脫毒快繁技術研究［J］．中國農學通報，2012，28(31):201 －205．

［6］許傳俊，黃珺梅，曾碧玉，等．植物組織培養脫毒技術研究進展［J］．安徽農業科學，2011，39(6):1318 －1320，1335．

［7］HAN Y J，LI J P，WANG Y H．Comparative study on the efect of different fertilizers on the growth and development of Halenia elliptica D．Don［J］．Agricultural Science＆Technology，2008，9(3):137 －140．

［8］王超，王文和，趙祥云，等．合病毒脫除技術研究［J］．北京農學院學報，2012，27(4):25 －28．