核桃炭疽病生防菌yb33的鑒定及其次生代謝物特性分析

韓長志，霍 超

（西南林業大學a.林學院；b.云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224）

核桃炭疽病生防菌yb33的鑒定及其次生代謝物特性分析

韓長志a,b，霍 超a,b

（西南林業大學a.林學院；b.云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224）

為了較好地利用生防菌防治核桃炭疽病，采用土壤稀釋平板法和對峙培養法，從核桃根際土壤中分離篩選獲得了yb23、yb31、yb33、yb34菌株（其對核桃炭疽病菌的抑菌活性均在60%以上），然后對其中生防效果較好的菌株yb33進行了形態學與分子生物學鑒定，并對該菌次生代謝產物的性質進行了分析。鑒定結果表明：菌株yb33為芽孢桿菌屬細菌，其與Bacillus axarquiensis的親緣關系最近。分析結果表明：不同濃度yb33無菌濾液的抑菌效果間具有明顯的差別，其在65 ℃及其以下溫度條件下的熱穩定性較好。

核桃炭疽病菌；yb33；枯草芽孢桿菌；生物防治

云南省的核桃生產在全國核桃生產中占有非常重要的地位，其核桃栽培面積和產量約占全國的1/3[1]。種植核桃歷史較為悠久的大理州漾濞彝族自治縣作為云南省五個“全國經濟林核桃之鄉”之一，其核桃產量、品質均居云南省首位[1]。然而，由膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的核桃炭疽病是近幾年核桃樹遭到的重要真菌病害，嚴重地危害著當地核桃產業健康、有序、快速的發展。據近3年對漾濞核桃產區核桃炭疽病的病害調查結果，病害嚴重的年份該病發生率高達90%以上，這給當地核桃生產造成了較為嚴重的經濟損失。

核桃生產中對于核桃炭疽病的防治主要依賴于化學藥劑，而病原菌的抗藥性逐年顯現[2-4]，特別是該病害發展迅速，急需開發適用于生產的優良藥劑[5]。目前，學術界對于化學藥劑的替代品生防菌的研究報道逐年增加，對生防菌的篩選與研究多集中于農作物[6]、蔬菜[7]等領域，而對于木本油料作物生防菌的研究報道卻較少。前人在對核桃炭疽病生防菌的篩選研究中發現，短芽孢桿菌Bacillus brevisPF-2對C. gloeosporioides的抑菌率最高（88.47%），還有3株均屬于芽孢桿菌屬的細菌對核桃炭疽病菌也有83%以上的抑菌率[8]。盡管如此，由于生防菌具有地域局限性特點[9]，對于能用以防治云南省核桃炭疽病的生防菌的研究卻尚未見諸報道。為此，以來自于當地的核桃炭疽病菌作為指示菌，從核桃種植地根際土樣中分離出拮抗效果較好的生防細菌，并對其次生代謝物的特性進行了研究，以期為當地核桃炭疽病的生物防治提供菌株資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤樣本：選擇發病程度不同的核桃根際周圍的土壤，鏟去10 cm的表土層，取10～15 cm處的土樣50～200 g，共取土壤樣本8份。

供試菌株：西南林業大學植物病理學實驗室保存的核桃炭疽病菌菌株yb-1。

培養基：葡萄糖瓊脂培養基（PDA）用于核桃炭疽病菌的培養，肉湯蛋白胨固體培養基（NA）用于土壤細菌的分離培養，馬鈴薯葡萄糖＋0.5%牛肉浸膏培養基用于分離細菌發酵液的培養。

1.2 土壤生防菌的分離與純化

采用土壤稀釋平板法進行分離[10]，置于28 ℃的恒溫培養箱中培養24 h后，平板劃線進行純化，每處理重復4次，獲得菌株，并進行編號，然后置于4 ℃的冰箱中保存以備用。將分離得到的菌株以“yb”為開頭字符進行編號，“yb”字符后的前一個編碼表示土壤樣本的編號，后一個編碼表示菌株的編號，如yb11，即從1號土樣中分離到的1號菌株。將分離到的菌株經純化后轉入試管斜面保存以備用。

1.3 生防菌株的篩選

采用平板對峙培養法[11]進行篩選，根據處理病原菌生長直徑和對照病原菌生長直徑的差異來計算抑菌率，計算公式為：

抑菌率(%)＝(對照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/對照組菌株菌落直徑×100。

先對所獲得的全部菌株進行初次篩選，病原菌和土壤分離菌的比例為1∶4，記錄抑菌圈的大小，篩選出效果較好的菌株；然后對初次篩選出的效果較好的菌株進行第二次篩選即復篩，病原菌和土壤分離菌的比例為1∶2，記錄抑菌圈的大小，篩選出對病原菌作用效果明顯且穩定的生防菌株，以備后續研究之用。

1.4 對yb33的形態學及分子生物學鑒定

將在NA平板上培養24 h的菌株yb33裝片，在生物顯微鏡尼康E800下觀察菌株的微觀形態，并測定其大小，根據革蘭氏染色呈現出的顏色和形態特征，依據《常見細菌系統鑒定手冊》進行鑒定[12-13]。

挑取以NA培養基培養的菌落，將其置于肉湯蛋白胨培養液中過夜培養，過濾，提取菌 株 yb33的 DNA。PCR 反 應 體 系 為 50 μL，其 中，2×MasterMix 25 μL，DNA 5 μL， 上 游引物（27f）、下游引物（1492r）均為 5 μL，ddH2O 為 10 μL。 通 用 引 物 分 別 為 27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’） 和 1492r（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）；反應條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，72 ℃延伸5 min，35個循環。

利用瓊脂糖凝膠電泳技術檢測PCR擴增產物，選擇具有特異性條帶的樣品送至昆明碩陽科技公司測序。將所測序列與NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫中已報道的序列進行Blastn比對，確定其分類地位。同時，利用ClustalX[14]對已經報道的枯草芽孢桿菌及yb33進行多重比對分析，再利用MEGA 5.2.2軟件[15]構建系統進化樹，即采用鄰近法構建系統發育樹，采用p-distance模型計算各分支之間的距離，采用自舉法，重復1 000次，對系統的可信度進行檢測。

1.5 yb33次生代謝產物的提取

將在NA上培養24 h的yb33接種于馬鈴薯葡萄糖＋0.5%牛肉浸膏培養液中，于轉速為200 r/min、溫度為30 ℃的搖床上振蕩培養48 h，取適量發酵液，室溫下以轉速為4 800 r/min離心20 min，獲得上清液，之后用孔徑為0.2 μm的細菌過濾器過濾，即得無菌濾液，將無菌濾液置于4 ℃的冰箱中保存以備用[16]。

1.6 yb33次生代謝產物抑菌活性及熱穩定性的測定

采用平板稀釋法，將yb33無菌濾液分別以1/10、1/50、1/100倍的比例與40 ℃左右的PDA培養基均勻混合，以未加無菌濾液的PDA作為對照。各平板中央接種直徑為6 mm的核桃炭疽菌菌絲塊，28 ℃下培養，每個處理4個重復。待對照菌落長滿培養皿時，用十字交叉法測量菌落直徑，并計算抑菌率。

在30、45、65、85、100、121 ℃的條件下對yb33無菌濾液分別處理10、30、60 min，與40 ℃左右的PDA培養基混勻，制成含有濃度為1/10的無菌濾液的PDA平板，以無菌水和未經熱處理的無菌濾液作為對照，其處理方法同上。

2 結果與分析

2.1 土壤生防菌的分離和篩選

經初篩總共獲得33個菌株，其中抑菌率超過60%的菌株有7個，其編號分別為yb21、yb42、yb23、yb31、yb33、yb34、yb41；將上述初篩出的菌株進行復篩，結果發現，菌株yb33、yb31的抑菌效果最好，可達80%以上，其與病原菌相接處有很明顯的拮抗菌帶，抑菌效果明顯且穩定。土壤拮抗菌株初篩與復篩的抑菌效果詳見表1與圖1。

2.2 yb33的鑒定及遺傳關系分析

對yb33的形態特征進行觀察，結果如圖2A～C所示。圖2A～C顯示，菌落表面粗糙不透明，呈污濁的白色或微黃色，該菌落呈桿狀，有芽孢，單個細胞的大小為（0.7～0.8）×（2.0～3.0）mm，經革蘭氏染色呈陽性，著色均勻。

表1 土壤拮抗菌株初篩與復篩的抑菌效果Table 1 Antifungal effects of antagonistic strains obtained by preliminary screening and second screening

圖1 yb33和yb31的抑菌效果Fig. 1 Antifungal effects of yb33 and yb31

圖2 yb33形態特征的鑒定結果Fig. 2 Identification result of yb33 based on morphological characteristics

依據《常見細菌系統鑒定手冊》[13]對該菌株進行鑒定，同時對其16S RNA序列進行克隆、測序等分子生物學鑒定，通過NCBI比對分析，明確了yb33與枯草芽孢桿菌屬包括Bacillus mojavensisstrain SWFU16、Bacillus tequilensisstrain YJ-S4、Bacillus mojavensisstrain 263XG8等菌種在內的眾多菌株相一致，此外，結合已經報道的芽孢桿菌序列[17]進行遺傳關系分析，結果（如圖3）表明，諸多已經報道的枯草芽孢桿菌屬可以分為六大類，其中，yb33與Bacillus axarquiensisstrain 261MG2的親緣關系最近，屬于A類。

圖3 yb33與芽孢桿菌屬其他菌之間的遺傳關系分析Fig. 3 Genetic relationships analysis of yb33 strain and other strains in Bacillus

2.3 yb33次生代謝產物的抑菌作用

與yb33菌株具有抑菌作用相似，其無菌濾液對核桃炭疽病菌也有較好的抑制作用，能減慢病原菌菌絲的生長，濃度為0.1時，抑菌效果高達92.86%，然而，隨著濃度的減小，抑菌效果明顯減弱，濃度為0.02時，抑菌率為29.76%，濃度減到0.01時，抑菌率只有14.29%，上述結果表明，不同濃度無菌濾液的抑菌效果之間具有明顯差別，推測無菌濾液中含有抑制病原菌生長的拮抗物質（如圖4所示）。

圖4 不同濃度無菌濾液對病原菌生長的影響Fig. 4 Effect of different concentrations of sterile filtrates on growth of pathogens

2.4 yb33次生代謝產物的熱穩定性

yb33無菌濾液的抑菌效果在65 ℃及其以下的熱穩定性較好，處理10～60 min后，其抑菌效果變化波動比較??；而65～100 ℃處理下，其抑菌效果變化波動非常大，特別是在121 ℃處理下，其抑菌效果則出現較大的變化（圖5）。同時發現，相同溫度不同時間處理也會對抑菌效果產生影響，即隨著處理時間的增加，其無菌濾液的抑菌效果則減弱（圖5）。上述結果表明，yb33無菌濾液在室溫條件以及較為極端的自然溫度條件下具有較好的熱穩定性，具有進一步作為生防菌資源的潛力。

圖5 無菌濾液經不同溫度不同時間處理后的抑菌效果Fig. 5 Antifungal effects of sterile filtrates after treated for different time at different temperatures

3 結論與討論

近年來，國內外學者對于生防菌篩選的研究開展了大量工作，盡管如此，對于木本油料作物的重要病害的生防菌的研究報道卻較為少見[18]，同時，鑒于生防菌具有較強的地域性特點，本研究采用對峙培養法對分離于云南省漾濞縣核桃根際周圍土壤的拮抗核桃炭疽病菌的生防菌進行了篩選，結果顯示，枯草芽胞桿菌屬細菌yb33對核桃炭疽病菌具有較好的抑菌效果，其無菌濾液具有較好的抑菌效果和熱穩定性，作為田間生防菌其有進一步研究的潛力。

目前研究報道的生防菌主要包括芽孢桿菌、假單胞桿菌、放射性土壤農桿菌和巴氏桿菌等種細菌，尤以枯草芽胞桿菌屬細菌居多，如XG-1對西瓜枯萎病菌菌絲生長具有較強的抑制作用[19]，Henu11對禾谷絲核菌具有較好的抑制作用[6]，N-193對辣椒炭疽病菌具有明顯的拮抗作用[20]。此外，枯草芽孢桿菌OBS-2對尖鐮孢香草蘭專化型和腐皮鐮孢菌能產生明顯的拮抗帶，且該菌株較外地菌株（1.936菌株）的生防效果要好[9]，因此，篩選本地枯草芽孢桿菌更具有實際應用價值。

此外，對于云南省漾濞縣核桃的研究還有關于引種核桃品種嫁接成活率及苗期生長性狀[21]方面的報道，而對于其他省份不同核桃品種的遺傳多樣性[22]也有一些研究報道，然而，尚缺乏對于核桃上諸多病害的系統研究以及利用生防菌開展某種病害防治的研究報道，這將成為未來核桃研究的重要方向。

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Identification of bio-control strain yb33 against walnut anthracnose and analysis of its secondary metabolite characteristics

HAN Chang-zhia,b, HUO Chaoa,b
(a. Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province; b. College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China)

In order to better utilizing bio-control strains against walnut anthracnose, the strains of yb23, yb31, yb33 and yb34 were isolated by using soil dilution plate method and dual culture method, which had over 60% of the antifungal activity. The yb33 strain with higher antifungal activity was identified from the aspects of morphology and molecular biology, and characteristics of its secondary metabolites were analyzed. The results showed that, yb33 strain belongedBacillus subtilis, and had close genetic relationships withB. axarquiensis.Antifungal effects had significant differences between the yb33 sterile filtrates at different concentrations, and the sterile filtrates had good thermal stability at below 65 ℃.

walnut anthracnose; yb33;Bacillus axarquiensis; bio-control

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.03.011 http: //qks.csuft.edu.cn

2014-10-04

云南省優勢特色重點學科生物學一級學科建設項目（50097505）；云南省高校林下生物資源保護及利用科技創新團隊項目（2014015）；云南省教育廳科學研究基金項目（2014Y330）。

韓長志，講師，博士。E-mail：hanchangzhi2010@163.com

韓長志,霍 超.核桃炭疽病生防菌yb33的鑒定及其次生代謝物特性分析[J].經濟林研究,2015,33(3):63－67, 74.

S664.1

A

1003—8981(2015)03—0063—05

[本文編校：伍敏濤]