復方中草藥提取物抑菌活性成分研究

劉 敏 周 茜 郝紅偉 王唯霖 劉新愚 趙 文（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001）

從中草藥篩選抗菌藥物用于防治疾病已經成為解決抗生素濫用問題的有效途徑之一。近年來，有很多研究［1－7］從不同的角度，對中草藥的抑菌作用進行了多方面的探討。結果顯示，很多中藥能阻止病原微生物的生長，屬天然的抑菌材料。但是中藥是典型的復雜物質體系，如何從中篩選出藥效物質，又如何將它們進行有效分離，其被分離產物能否代表中藥的功用，這些實質上就是中藥提取分離技術領域所面臨的科學問題。

目前對中藥復方有效部位研究常采用現代分離提取方法，將其分離成為各個有效部分，如揮發油、生物堿類、黃酮類、香豆素類、多糖類等。每個有效部分又可以分為化學性質相近的化合物群，這樣一個復雜的中藥復方就可以分為幾種或十幾種有效部位，再和藥效學相結合就可以闡明中藥復方協同配伍的化學物質基礎。因此研究人員提出了包括現代分離方法提取有效成分，指紋圖譜定性，指標成分定量，有效成分和藥效學研究相結合的整體中藥復方研究思路，如對銀翹散［8］、四逆散［9］、清腦宣竅方［10］等中藥材的研究。本課題組［11］前期研究表明，以烏梅、馬齒莧、大青葉為主要成分的復方中草藥具有一定的抑菌作用。目前，中國關于烏梅、馬齒莧、大青葉的抑菌作用及成分的報道較多。劉夢茵等［12］通過薄層層析—生物自顯影技術初步確定了烏梅醇提物中起主要抑菌作用的是有機酸。馬齒莧中含有有機酸類、黃酮類、萜類、香豆素類、生物堿類、揮發油和多糖［13］，其中馬齒莧多糖具有一定的抑菌、消炎作用［14］。大青葉對脆弱類無芽孢厭氧桿菌也有較強的抑制作用。其抗菌有效成分為色胺酮和一些吲哚類衍生物［15］。本研究擬在前期研究［11，16］的基礎上，采用有機溶劑萃取法確定該復方中草藥的抑菌活性部位。課題研究初期，考慮到中草藥成分的復雜性，不可能把每一種成分都提取出來進行成分的鑒定，參照組分中藥研究的思路，采用系統分離的方法將中草藥水提液精制后分為低、中、高三類不同的極性組分，而后通過體外抑菌試驗篩選出了抑菌作用最強的組分。旨為進一步研究該復方的藥效成分提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

烏梅、馬齒莧、大青葉、野菊花、魚腥草、柴胡、黃柏、香薷、生地：購于保定市某藥房。

1.2 試劑

95%乙醇：分析純，天津市紅巖化學試劑廠；

正己烷、二甲基亞砜（DMSO）：分析純，天津市福晨化學試劑廠；

乙酸乙酯：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；

正丁醇：分析純，天津市光復科技發展有限公司；

氯化鈉：分析純，天津市瑞金特化學品有限公司；

營養瓊脂：分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司；

牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出物：分析純，北京雙旋微生物培養基制品廠。

1.3 菌種

大腸桿菌O157：H7、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌：由河北農業大學食品科技學院微生物實驗室提供，本實驗室斜面保藏。

1.4 儀器與設備

旋轉蒸發器：RE－52A型，上海亞榮生化儀器廠；

冰箱：BCD－205F/T型，海爾集團；

電子天平：SB1.T－014型，上海奧豪斯國際貿易有限公司；

電熱恒溫干燥箱：202－1－BS型，上海躍進醫療器械廠；

生化培養箱：SPX－150S－Ⅱ型，上海新黃醫療器械制造有限公司；

潔凈工作臺：SW－CJ－1FD型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌器：YXQ.SG41.280型，上海華線醫用核子儀器有限公司；

移液槍：DS14364型，容量100～1 000μL，大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；

高速多功能粉碎機：BL－100型，浙江省永康市松青五金工具廠；

超聲波清洗機：QTSX/6150型，奇拓儀器有限公司；

水浴鍋：HH－2型，江蘇省常州國華電器有限公司；

酸度計：PHS－3C型，上海康儀儀器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 復方中草藥提取物的制備 將烏梅、馬齒莧、大青葉、野菊花、魚腥草、柴胡、黃柏、香薷、生地按文獻［11］的方法制備中草藥水煎液，4℃下保存備用。

1.5.2 醇沉條件的優化 醇沉技術可以有效去除水提液中的大分子及多糖類物質，達到精制的目的。在醇沉條件優化中，根據參考文獻［17～19］以及預試驗的結果，得到濃縮液的密度為0.5g/mL和醇沉24h效果最好，所以只考察了含醇量的影響。選取乙醇終體積分數為60%，70%，75%，80%，85%，90%進行醇沉提取。

按前期研究［16］的處方量稱取烏梅等100g，按水提工藝提取，濃縮至質量濃度為0.5g/mL，藥液放冷后，用90%的乙醇邊攪拌邊加入至規定體積分數，4℃密閉冷藏24h，傾取上清液濾過，沉淀用規定濃度的乙醇洗滌，合并濾液，濾液回收乙醇至無醇味，回收液置已恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3h，移至干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定重量，以浸出物與原生藥量之比作為干膏率。根據干膏率確定最佳提取工藝。

1.5.3 復方中草藥的抑菌活性部位確定

（1）樣品溶劑的選擇：考慮到有機溶劑會對微生物的生長有一定的影響，影響后期抑菌試驗的進行［20］，需要選取一種既能溶解不同極性的物質，又不會對微生物的生長產生影響的溶劑。

試驗選用蒸餾水、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、20%DMSO，40%DMSO，60%DMSO，80%DMSO 及 純 DMSO進行提取物溶解能力的試驗。同時用這幾種溶劑進行大腸桿菌O157：H7、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌抑菌試驗。

（2）提取方法：采用不同極性的溶劑對提取物進行萃取，富集抑菌有效組分，依次用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇進行，每種溶劑等體積萃取3次。而后減壓旋蒸回收溶劑，真空干燥至干，得4種極性的浸膏。

（3）抑菌試驗：在明確了不同溶劑抑菌作用的前提下，選擇各部浸膏適合的溶劑，均配制成2.0g/mL溶液備用。

將已計數的大腸桿菌O157：H7、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌菌液稀釋到106CFU/mL，采用牛津杯法對不同極性復方中草藥提取物進行抑菌試驗。培養結束后，觀察牛津杯周圍是否有透明圈，若有，測量其大小；若沒有，表明該極性部分對菌無抑制作用。

2 結果與分析

2.1 醇沉條件的優化

由表1可知，當乙醇體積分數達到70%時，干膏率趨于平穩，乙醇濃度達到85%以上時，干膏率逐漸降低。因此，根據試驗結果，結合生產成本，選擇70%做為最佳醇沉濃度。由此得到醇沉最佳工藝條件為：水煎液密度0.5g/mL，乙醇體積分數70%，4℃下靜置24h。

表1 醇沉條件選擇Table 1 Optimization of ethanol－precipitation（n＝3）%

2.2 復方中草藥的抑菌活性部位確定

2.2.1 樣品溶劑的選擇 由表2可知，正己烷及乙酸乙酯均無抑菌作用，可以作為正己烷相及乙酸乙酯相的溶劑，正丁醇有極強的抑菌作用，不可作為正丁醇相的溶劑。溶解能力試驗中正己烷能夠完全溶解正己烷相浸膏，而乙酸乙酯不能完全溶解乙酸乙酯相浸膏。因此，選用正己烷為正己烷相浸膏的溶劑。

表2 溶劑抑菌效果Table 2 The antibacterial effect of the solvent（n＝3）mm

表2 溶劑抑菌效果Table 2 The antibacterial effect of the solvent（n＝3）mm

“—”表示無細菌生長，被完全抑制。

溶劑 大腸桿菌O157：H7腸炎沙門氏菌 金黃色葡萄球菌正己烷6.00 6.00 6.00乙酸乙酯 6.00 6.00 6.00正丁醇 — — —

由表3可知，20%的DMSO對微生物的生長無影響，DMSO的濃度越大，抑菌作用越大。而80%的DMSO才能全部溶解乙酸乙酯相浸膏。

表3 DMSO對兩種致病菌的抑菌圈直徑Table 3 Antibacterial diameter of DMSO（n＝3）mm

表3 DMSO對兩種致病菌的抑菌圈直徑Table 3 Antibacterial diameter of DMSO（n＝3）mm

“—”表示無抑菌效果。

DMSO濃度/% 大腸桿菌O157：H7金黃色葡萄球菌20——40 8.13±0.21 5.97±0.25 60 11.06±0.32 12.10±0.36 80 16.13±0.30 15.70±0.66 100 19.87±0.51 18.86±0.32

綜合所述，本試驗中樣品溶劑選擇方式為：正己烷溶解正己烷相浸膏，80%的DMSO溶解乙酸乙酯相浸膏，蒸餾水溶解正丁醇相、水相浸膏。

2.2.2 抑菌試驗結果 由表4可知，復方中草藥水煎液對3種菌均有一定的抑制作用。對腸炎沙門氏菌的抑制作用最強，金黃色葡萄球菌次之，對大腸桿菌O157：H7的抑制作用最弱。醇沉上清液對3種菌都有明顯的抑制作用，并且抑菌強度較水煎液有明顯的增強。醇沉后的沉淀物對3種菌基本無抑制作用。由此可知，水提醇沉起到了很好的去除中藥水煎液中雜質的作用。

由表5可知，正己烷相無抑菌作用，其余各相對3種致病菌均有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯相對3種菌的實際抑菌圈直徑均需扣除空白80%DMSO的抑菌圈直徑。乙酸乙酯相對3種菌的抑制作用強弱順序為：腸炎沙門氏菌＞大腸桿菌O157：H7＞金黃色葡萄球菌。正丁醇相有較強的抑菌作用，對3種菌的抑制作用強弱相近。水相也有較好的抑菌作用，對大腸桿菌O157：H7及腸炎沙門氏菌的抑制作用較強，金黃色葡萄球菌抑制作用次之。各相抑菌作用強弱順序為：正丁醇相＞水相＞乙酸乙酯相＞正己烷相。由此可見，抑菌活性物質主要是一些高極性的物質，其余物質發揮協同作用。

表4 樣品的抑菌圈直徑Table 4 Antibacterial diameter of the samples（n＝3）mm

表5 樣品的抑菌圈直徑Table 5 Antibacterial diameter of the samples（n＝3）cm

3 結論

本研究確定了復方中草藥提取物中的抑菌活性成分探究的前處理方式為水提醇沉。醇沉最佳工藝條件為：水煎液密度0.5g/mL，乙醇體積分數70%，4℃靜置24h。采用有機溶劑萃取法將復方中草藥提取物中的成分分為4個不同的極性部分。體外抑菌試驗中，溶劑的選擇是一個難點。本研究選用的溶劑DMSO本身就對微生物的生長有很大的影響，試驗的目的是確定該極性部分是否有抑菌作用，因此對試驗結果有一定的干擾。通過試驗，正己烷提取物與空白相比抑菌圈直徑相近，因此認為其無抑菌作用，而乙酸乙酯提取物抑菌圈直徑比空白的大，因此判定這部分物質有一定的抑菌作用。各相的抑菌作用強弱順序為：正丁醇相＞水相＞乙酸乙酯相＞正己烷相。表明抑菌活性物質主要是一些高極性的物質，其余物質發揮協同作用。這與劉夢茵等［12－15］關于烏梅、馬齒莧、大青葉中抑菌物質的研究結果相一致。在今后的研究中需對強極性部分的主要成分進行闡述，進一步揭示該復方的抑菌活性成分。

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