納米磁性四氧化三鐵固定脂肪氧合酶的研究

丁文武 曹汝毅 孫銘珍 夏云空（.西華大學生物工程學院，四川 成都 6009；.山東師范大學歷山學院，山東 濟南 5004；.四川大學生命科學學院，四川 成都 6009）

脂肪氧合酶是一類較為常見的酶，應用前景廣闊，可用于染料、涂料和洗滌劑等工業化生產［1－3］。然而，由于脂肪氧合酶在動植物中含量低、分離純化難導致其價格高，穩定性也較差，難以在工業上廣泛應用。將酶固定化可以加強酶的穩定性，并可以重復利用從而降低生產成本。因此，酶固定化技術一直是酶應用研究領域中一項引人注目且非常重要的課題［4］。

用于固定化酶的載體和方法有很多，其中采用磁性微球固定化酶，不僅會大大提高酶的穩定性［5］，而且利用載體具有磁性的特點可以組裝成磁性流化床或固定床反應器，有利于固定化酶的進一步應用［6］，因此磁性微球固定化酶的研究成為許多研究者［7－9］青睞的課題。目前，用于固定化酶的主要載體之一是納米Fe3O4。納米Fe3O4的制備方法有多種，如水熱法、溶膠—凝膠法和共沉淀法等［10］。此外，由于納米Fe3O4離子具有非常大的比表面積以及比表面能，從而導致其在制備以及應用過程中極易發生團聚，進而嚴重影響其使用，因此必須對其進行表面改性以消除影響［11］。將酶固定在磁性微球上的方法主要有吸附法和共價法等［12］，盡管酶的固定化方法很多，但到目前為止，很難找到一種適用于各種酶的固定化方法，因此，研究并找到適宜的固定化方法仍是固定化酶研究的熱點課題［13］。

本研究擬通過水熱法制備納米磁性Fe3O4，并用SiO2和KH550對粒子進行表面修飾得到納米磁性載體，然后用交聯法固定脂肪氧合酶，研究影響酶活的因素，討論固定方法的適宜性，以便為該酶找到合適的固定化方法，從而為其進一步的應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料與試劑

硝酸鉀、氫氧化鉀、七水合硫酸亞鐵、無水乙醇、正硅酸四乙酯、氨水、亞油酸等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

石油醚：化學純，天津市富宇精細化工有限公司；

戊二醛、過氧化氫：分析純，成都市科龍化工試劑公司；

Tween－20（CP）：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

KH550：化學純，浙江新安有機硅試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

pH計：PHS－25CW型，上海般特儀器制造有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK－S28型，上海森信儀器有限公司；

雙光束紫外可見分光光度計：TU－1901型，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 納米磁性載體的制備 分別向圓底燒瓶中加入濃度為0.6moL/L、體積為25mL的 Na2S2O3·5H2O溶液和濃度為4.0moL/L、體積為25mL的NaOH溶液，攪拌混合均勻，再向燒瓶中逐滴加入濃度為4.0moL/L、體積為50mL的FeSO4·7H2O溶液，持續攪拌1h后，將體系轉移至反應釜，加熱至160℃使其持續反應16h，取出反應體系，用磁鐵將體系中黑色物質分離出來并水洗3次，得到黑色物質即為納米磁性Fe3O4；室溫下，將100mL乙醇、10mL水和2.5mL正硅酸四乙酯分別加入燒瓶中，攪拌5min后，向其中加入2.0mL的濃氨水以及制備的納米Fe3O4，繼續攪拌10h后，磁鐵分離獲得SiO2包裹的納米Fe3O4；將54g乙醇、3g水及2.28g KH550分別加入燒瓶中，水解10min后，加入上述步驟制備的SiO2包裹的納米Fe3O4，在氮氣保護下攪拌2h后，磁鐵分離即獲得以SiO2和KH550修飾的納米磁性載體，保存備用。

1.2.2 脂肪氧合酶的固定化 將大豆粉碎，然后用40目的篩子篩分去皮，再按照固液比為1∶5（m∶V）的比例用石油醚對大豆浸提5次；取50g脫脂大豆粉于圓底燒瓶中并加水350mL，室溫下攪拌1h后，攪拌液于4 000r/min離心20min，收集上清液即為粗酶液，保存備用；取1.5g納米磁性載體和50mL粗酶液加入到燒瓶中，超聲使其分散后，加入1.0g戊二醛（占體系總量2%），常溫攪拌2h后，以強力磁鐵分離出反應液中的固體物質，并用水洗滌3次后，即得納米固定化酶微粒，密封于4℃下保存備用。

1.2.3 底物溶液的配制及酶活的測定 參照文獻［14］。

1.2.4 酶活影響因素的測定

（1）pH值的影響：將粗酶液（或固定化酶0.05g）加入到pH分別為6，7，8，9，10的反應體系中，20℃反應后，進行酶活測定。

（2）溫度的影響：將粗酶液（或固定化酶0.05g）置于溫度分別為20，25，30，35，40，45℃的水浴中進行反應后，測定酶活。

（3）H2O2濃度的影響：將粗酶液（或固定化酶0.05g）加入到 H2O2濃度分別為0，3，6，9，12，15，18g/L的反應體系中，恒溫（游離酶30℃，固定化酶25℃）反應后進行酶活測定。

2 結果與分析

2.1 納米Fe3O4形貌分析

對固定化酶而言，載體結構和組成直接影響著固定化酶的活性及其催化效率。將制備好的Fe3O4粒子在無水乙醇中超聲分散一定時間后，用電子顯微鏡進行觀察。由圖1可知，載體為亮黑色短棒狀粒子，平均長度約為600nm，平均粒徑約為40nm，由于制備的粒子粒徑屬于納米范圍，從而具備了很高的比表面積，因此使得粒子具有非常高的表面自由能［15］，而粒子之間的團聚可以有效降低表面自由能，使體系逐漸趨于穩定，因此從圖1中可以所看到粒子有一定的聚集。

圖1 Fe3O4納米粒子電鏡圖Figure 1 TEM image of naked Fe3O4nanoparticles

2.2 Fe3O4及固定化酶的XRD分析

Fe3O4及固定化酶的XRD分析見圖2。Fe3O4會在2θ為30.1°，35.5°，43.1°，53.3°，57.4°，62.3°下出現了6個特征峰，而由圖2可知所檢測的固定化酶出現了與Fe3O4相同的特征峰，說明對Fe3O4的表面修飾和酶的固定化，并沒有改變合成的磁性納米Fe3O4的內部晶體結構，表明納米Fe3O4能在反應過程中很好地保持其磁性等特性，從而有利于其在后續的反應過程中進一步應用，也證明了可以以納米Fe3O4粒子作為固定化脂肪氧合酶的載體進行探索和研究。

2.3 熱失重分析

圖2 Fe3O4及固定化酶的XRD分析Figure 2 XRD patterns of bare Fe3O4and immobilized enzyme

圖3 固定化酶的熱失重分析Figure 3 TGA of immobilized enzyme

由圖3可知，熱失重曲線的形狀帶有過渡和傾斜區段；曲線的水平部分表示顆粒的質量恒定沒有發生變化，而帶有斜率的部分表示顆粒的質量發生了變化。溫度在0～200℃時，納米磁性載體和固定化酶的失重大約有1%和5%，這部分失重是因載體上的可揮發物和水分揮發等損失造成的，隨著溫度的繼續升高，脂肪氧合酶和其他包裹物都會被逐漸燒掉，當溫度達到600℃左右時，曲線逐漸趨向水平，此時剩下的物質為Fe3O4，而脂肪氧合酶等都已經被全部燒掉，據此計算，載體上脂肪氧合酶的固定量約占固定化酶顆粒質量的14%。

2.4 pH對酶活性能的影響

游離酶和固定化酶的活性測定結果見圖4，固定化酶的最適pH為9.0，游離酶的最適pH為8.0。pH值對酶活的影響，主要是通過影響酶分子活部位上的有關基團，從而進一步影響與底物的結合與催化；固定化酶最適pH值向堿性一側發生偏移，主要原因可能是納米磁性微粒作為一種復合的堿性氧化物，對酸的耐受性較差，在堿性的環境下，固定化酶比游離酶有更寬的適應范圍［16］，但隨著pH值的不斷升高，無論游離酶還是固定化酶均將逐漸失活。

圖4 pH對游離酶和固定化酶的活性影響Figure 4 Effect of pH on free and immobilized enzyme activity

2.5 溫度對酶活性能的影響

由圖5可知，溫度對酶促反應速率的影響比較大，游離酶的最適溫度為30℃，而固定化酶的最適溫度為25℃，且在25～35℃內都保持了較高的酶活力，說明固定化酶擴大了反應溫度范圍，對溫度的敏感性有所下降；而對脂肪氧合酶的利用和處理都應盡量在低溫下操作，以便保持較高的酶活［14］，所以將脂肪氧合酶的固定化有利于降低酶對溫度的苛刻要求。

2.6 雙氧水對酶活性能的影響

圖5 溫度對游離酶和固定化酶的活性影響Figure 5 Effect of temperature on free and immobilized enzyme activity

圖6 H2O2濃度對游離酶和固定化酶的活性影響Figure 6 Effect of H2O2concentration on free and immobilized enzyme activity

由圖6可知，游離酶和固定化酶的活性都隨著H2O2濃度的增加而增加，當H2O2濃度為12.0g/L時，酶的活性達到最高，當H2O2濃度繼續增加時，酶的活性開始降低，可能是前期加入H2O2起到了誘發酶活性的作用，但環境中過多的H2O2會改變酶的結構，從而抑制酶的活性［17］。最后在最適條件下經測定，游離酶的酶活約為1.82×103U/mL，固定化的酶活約為2.31×103U/g。

3 結論

本試驗采用水熱法制備了納米磁性四氧化三鐵，然后用SiO2和KH550對其表面進行表面修飾得到復合納米四氧化三鐵載體，再用戊二醛將脂肪氧合酶固定在復合載體上；通過電鏡觀察，合成得到的納米磁性四氧化三鐵呈亮黑色短棒狀粒子；通過XRD分析得到合成的顆粒具有四氧化三鐵的特征峰，且這些特征峰在經過對顆粒的表面修飾和酶的固定化后仍然得到了保持；通過熱失重分析得到，載體上酶的含量占載體質量的14%；通過對酶活的影響因素考察得到，游離酶的最適溫度為30℃，最適pH 8.0，H2O2濃度達到12.0g/L時，酶活達到最高，最適條件下酶活為1.82×103U/mL；固定化酶的最適溫度為25℃，最適pH 9.0，H2O2濃度為12.0g/L時，酶活最高，最佳條件下酶活為2.31×103U/g。結果表明以納米磁性四氧化三鐵固定脂肪氧合酶方法適宜可行，因而在此基礎上，可將以該材料固定化的脂肪氧合酶進一步進行應用研究，如氧化氯丙嗪或發酵產生香味物質等，同時也可以進一步研究該酶的性質，如酶的半衰期、穩定性及使用次數等。

1 Gardner H W.Recent investigations into the lipoxygenase pathway of plants［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1991，1 084（3）：221～239.

2 Feussner I，Wasternack C.The lipoxygenase pathway［J］.Annual Reviewof Plant Biology，2002，53：275～297.

3 蔡琨，方云，夏詠梅.植物脂肪氧合酶的研究進展［J］.現代化工，2003，23（增刊）：23～27.

4 李偉，孫建中，周其云.適用于酶包埋的高分子載體材料研究進展［J］.功能高分子學報，2001，14（3）：365～369.

5 錢斯日古楞，王紅英.磁性淀粉微球固定化脂肪酶的研究［J］.食品科學，2004，25（4）：47～49.

6 張世濤，梁茂雨，縱偉，等.磁場穩定流化床反應器水解牛乳中乳糖的研究［J］.食品與機械，2007，23（1）：18～20.

7 張媛媛，張暉，王立，等.磁性殼聚糖微球固定化米糠內源酶的研究［J］.食品與機械，2013，29（3）：51～54.

8 錢婷婷，楊瑞金，華霄.改性磁性殼聚糖微球固定化乳糖酶［J］.食品與機械，2011，27（1）：7～10.

9 縱偉，劉艷芳，趙光遠.磁性殼聚糖微球固定化脂肪酶的研究［J］.食品與機械，2008，24（1）：13～15.

10 季俊紅，季生福，楊偉，等.磁性Fe3O4納米晶制備及應用［J］.化學進展，2010，22（8）：1 566～1 574.

11 李國輝，李春忠，呂志敏.納米氧化鈦顆粒表面處理及表征［J］.華東理工大學學報，2000，26（6）：639～641

12 彥鋒，李軍榮，伏蓮娣.固定化酶的制備及應用［J］.高分子通報，2001，23（2）：13～17.

13 辛寶娟，邢國文.氧化鐵磁性納米粒子固定化酶［J］.化學進展，2010，22（4）：593～602.

14 蔡琨，方云，夏詠梅，等.大豆脂肪氧合酶的提取及影響酶活因素的研究［J］.林產化學與工業，2004，24（2）：52～56.

15 李黎，馬力.Fe3O4磁性微粒的制備及表征［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（34）：6 385～6 387.

16 羅建平，歐杰，潘利華.交聯β－葡萄糖苷酶聚集體的制備及其性質［J］.食品科學，2013，29（10）：254～258.

17 馮明.PDMS膜生物反應器生物轉化制備香草醛研究［D］.成都：四川大學，2007.