高密度固態培養產朊假絲酵母菌劑的工藝優化

徐 速 孫立斌 楊海明 孫 慧 江連洲（.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 50030；.黑龍江省輕工科學研究院，黑龍江 哈爾濱 5000）

益生菌是指有益于宿主健康的微生物活菌制劑［1］。隨著抗生素濫用和殘留問題的出現，益生菌劑的研究受到學術界廣泛關注。已有眾多實例證明，益生菌能刺激宿主腸道內生有益菌群平衡，抑制腸道中腐敗菌生長［2］，促進腸道中有害物質的降解與轉化，調節宿主免疫力，增加抗病能力［3，4］，從而提高動物的生產能力和增加養殖動物的經濟效益。

產朊假絲酵母是被廣泛公認的畜禽動物益生菌，早在1989年就已被美國FDA（美國食品和藥品管理局）和AAFCC（美國飼料官方協會）批準為可直接飼喂動物的安全菌株，2008年中國農業部也將其列入允許飼喂的菌種目錄［1］。酵母發酵飼料含有豐富的蛋白、小肽及氨基酸，增加飼料的營養價值［4］；產阮假絲酵母菌體所含蛋白質和維生素B含量均較高，且生長所需營養物質更簡單、可利用許多工農業副產物做原料生長繁殖［5，6］，菌體代謝后常常散發出宜人的香氣，可增加動物攝食欲望、提高生產能力。

中國每年加工大米、豆油、玉米后剩余大量副產物稻殼、豆粕、秸稈等，其中豆粕常用作替代玉米直接飼喂動物，原料利用率較低［6］；而秸稈、稻殼常常被農民廢棄或焚燒，浪費資源污染環境。J.Y.Choi等［4］研究了液態發酵益生菌劑和固態發酵益生菌劑對斷奶仔豬的影響，發現在提高生產性能和腸道有益微生物菌群、降低腸道有害微生物菌群方面，固態發酵優于液態發酵。固態發酵所制益生菌更利于益生菌的保存和活性的穩定，實際應用價值則更大。目前中國因生產麩皮的企業均在河南、河北、山東、山西等地，故在東北地區利用麩皮生產飼料酵母成本較高，而以秸稈稻殼替代麩皮固態發酵制備酵母菌還未見報道。本研究擬通過正交試驗、中心組合試驗設計及響應面分析法優化培養條件及培養基成分，為豆粕秸稈稻殼混合制備酵母益生菌劑提供基礎數據。同時，也對解決人畜爭糧矛盾、減少環境污染、改善農業生態環境具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

產阮假絲酵母2.118：黑龍江省應用微生物研究所菌種保藏中心；

酵母種子培養基：PDA液體培養基，121℃滅菌20min；

酵母菌種子液：將已活化的酵母菌斜面菌體一菌環接入PDA液體種子培養基，30℃搖床180r/min培養16h；

1.2 材料

稻殼、豆粕：購自飼料市場，豆粕粉碎過40目備用；

秸稈：取自哈市農戶自然干燥貯存，粉碎平均長度1～3 mm。

1.3 試劑與儀器

NaNO3、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4：分析純，天津天力化學有限公司；

粉碎機：HR2168型，珠海飛利浦家庭電器有限公司；

恒溫水浴鍋：DK－98－1型，天津泰斯特儀器有限公司；

生化培養箱：LRH－250型，上海一恒科技有限公司；

特大容量恒溫振蕩器：TDHZ－2002B型，太倉市華美生化儀器廠；

超凈工作臺：ZHJH－1109型，深圳市朗普電子科技有限公司；

高壓滅菌鍋：XYRX－20型，浙江新豐醫療器械有限公司；

電熱干燥箱：DHG－9240A型，上海精宏實驗設備有限公司；

真空干燥箱：DZF6090型，上海精宏實驗設備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微量元素溶液的制備

（1）1×微量元素溶液（m/V）：準確稱取分析純 NaNO30.6g、K2HPO40.2g、KCl 0.1g、MgSO4·7H2O 0.1g、Fe－SO40.002g，分別用少量蒸餾水溶解、合并后定容至100 mL，即得 NaNO30.6%、K2HPO40.2%、KCl 0.1%、MgSO4·7H2O 0.1%，FeSO40.002%的1×微量元素溶液，備用。

（2）2×微量元素溶液（m/V）：NaNO31.2%、K2HPO40.4%、KCl 0.2%、MgSO4·7H2O 0.2%，FeSO40.004%；3×微量元素溶液（m/V）：NaNO31.8%、K2HPO40.6%、KCl 0.3%、MgSO4·7H2O 0.3%，FeSO40.006%。制備方法同1.4.1（1）。

1.4.2 秸稈添加量對酵母菌生長的影響 固定每份原料總量40g，分別將豆粕∶稻殼∶秸稈按5∶2∶1，5∶2∶2，5∶2∶3，5∶2∶4，5∶2∶5比例混勻，再分別向每份原料添加50mL水及1×微量元素溶液，葡萄糖1g，在容器中混勻封口，121℃滅菌15min，冷卻，接種，鋪成2cm厚度，30℃培養24h，取樣，用血球計數器測定酵母菌數。每個樣品重復3次取平均值。

1.4.3 稻殼添加比例對菌體數目的影響 固定每份原料總量40g，分別將豆粕∶秸稈∶稻殼按5∶2∶1，5∶2∶2，5∶2∶3，5∶2∶4，5∶2∶5比例混勻，再分別向每份原料添加50mL水及1×微量元素溶液，1g葡萄糖，在容器中混勻封口，余下步驟同1.4.2。

1.4.4 碳源對酵母菌生長的影響 取原料豆粕、秸稈和稻殼按5∶2∶2混勻，每份40g，依次加入葡萄糖1，2，3，4，5 g，再分別向每份原料添加50mL水及1×微量元素溶液，混勻，余下步驟同1.4.2。

1.4.5 氮源對酵母菌生長的影響 取原料豆粕、秸稈和稻殼按5∶2∶2混勻，每份40g，向每份原料中依次加入硫酸銨0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g，或 尿 素 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g；再分別向每份原料加入50mL水及1×微量元素溶液，1g葡萄糖，余下步驟同1.4.2。

1.4.6 固態培養產朊假絲酵母活菌劑的生長曲線 取原料豆粕、秸稈和稻殼按5∶2∶2混勻，每份40g，分別向每份原料加入50mL水及1×微量元素，在容器中混勻封口，121℃滅菌15min，接種，鋪成2cm厚度，30℃培養12h后每隔2 h取樣，用血球計數器測定酵母菌數。每個樣品重復3次取平均值。

1.4.7 正交試驗確定最佳培養基成分 在碳源、氮源單因素試驗基礎上，對培養基成分中影響酵母菌生長數量的因素葡萄糖、硫酸銨、微量元素營養液添加倍數進行三因素三水平正交試驗，以確定最佳培養基成分配比。

1.4.8 中心組合試驗設計優化酵母菌固體培養條件 利用Design－Expert 7.0軟件，采用中心組合設計試驗方案建立關于接種量、固體培養基厚度、水分添加量和培養溫度四因素變量的二次回歸模型，以確定最佳培養條件，試驗設計因素水平見表1。選取接種量、厚度、水分添加量和發酵溫度4個因素為自變量，以酵母菌的菌數為響應值，以前期單因素試驗最佳結果為中心點，根據中心組合設計原理設計試驗。取5種水平自變量編碼，中心點試驗重復試驗數為6，試驗重復3次取平均值，每組試驗原料用量40g。

表1 中心組合試驗設計因素水平編碼表Table 1 Levels of independent variables of simplex－centroid design

1.4.9 酵母菌劑的干制 將最佳培養的酵母菌劑40℃真空干燥8h或常壓45℃干燥24h后，平板計數測定酵母菌活菌數。重復3次取平均值。

2 結果與分析

2.1 秸稈添加比例對酵母菌生長的影響

在實際操作中，豆粕滅菌后黏度增大，容易結塊，不利于氧氣的傳質。秸稈主要含纖維素、半纖維素、木質素等不易被酵母菌利用的成分，基質中添加適當比例的秸稈既起到機械支撐作用，又可增加培養基通透性和通氣量，利于氧氣的流通和酵母的增殖。由圖1可知，雖然隨著原料中秸稈比例的增加，酵母菌活菌數呈現下降趨勢，但當秸稈比例從1/8增加到4/11時，酵母菌對數值從8.4降到8.1，活菌數從2.6×108g－1降低到1.4×108g－1，仍保持在同一數量級，說明秸稈比例增加對酵母活菌數下降并不成正比，其影響趨勢較平緩。結合原料成本與活菌數量綜合考慮，選擇豆粕∶稻殼∶秸稈＝5∶2∶2較適宜。

圖1 秸稈添加量對酵母菌生長的影響Figure 1 Effects of corn straw on the growth of yeast

2.2 稻殼添加比例對菌種的影響

據資料［7］報道，稻殼含有大量纖維素、木質素、二氧化硅及少量的蛋白質和鈣磷元素，如不經處理，應用于飼料將影響動物的消化吸收率。雖然稻殼可利用的營養成分較貧乏，但試驗中發現稻殼具有良好的多孔性和吸水性，可作為固態發酵營養物質良好的載體，為固態發酵培養基提供良好的通氣性和保濕性。同時試驗中還觀察到，培養結束時培養基表觀濕度增大，分析可能是通過酵母菌的生長代謝產生了水分，增加了濕度所致。推測這將軟化稻殼中纖維素等成分，釋放更多的可溶性物質，增加培養基中菌體數目，從而增加菌體蛋白含量。由圖2可知，隨著稻殼添加量的增大，酵母菌的生長數量呈現先增加、后降低、然后趨于平穩的走勢，即添加比例（豆粕∶秸稈∶稻殼）從5∶2∶1至5∶2∶2時，酵母菌對數從8.37增加到8.47，酵母菌數量從2.3×108g－1增加至3×108g－1；當增至5∶2∶3以上時，酵母菌對數在8.25～8.33，酵母數保持在1.8×108～2.15×108g－1。綜合考慮，選擇豆粕∶稻殼∶秸稈＝5∶2∶2較為適宜。

2.3 碳源對酵母菌生長的影響

葡萄糖是酵母菌可以直接利用的碳源，在酵母生長代謝中既作為酵母菌細胞骨架，又作為代謝的能源物質。隨著市場上淀粉糖生產技術的提高，葡萄糖價格不斷下降，可作為酵母菌生長的輔助碳源。由圖3可知，在原料比例一定的條件下，起初酵母菌的數量隨著葡萄糖量的增加而增加，當葡萄糖增加到4g時，酵母菌生長數量達到最高，葡萄糖的添加量繼續增高時，酵母菌數量開始下降。推測可能是隨著葡萄糖添加量增加，酵母菌生長外環境碳源濃度的增大，導致酵母生長的外環境產生更高的滲透壓，影響酵母菌細胞代謝的進行，致使酵母菌生長速率減緩，數量下降。因此，選擇添加葡萄糖4g。

圖2 稻殼添加量對酵母菌生長的影響Figure 2 Effects of rice hull on the growth of yeast

圖3 葡萄糖對酵母菌生長的影響Figure 3 Effects of glucose on the growth of yeast

2.4 氮源對酵母菌生長的影響

尿素、硫酸銨、蛋白胨是常用的氮源，因蛋白胨的價格較高，而本試驗的目的是通過最小的花費獲得最大的酵母菌數量，所以選用尿素和硫酸銨做外加的氮源。由圖4可知，添加硫酸銨的效果為先揚后平，最佳添加量為0.4g，酵母菌最大數量4.25×108g－1。而添加尿素的效果為先揚后抑，最佳添加量為0.8g，酵母菌最大數量4.0×108g－1。目前市場上尿素的價格遠高于硫酸銨價格，且尿素添加量大于硫酸銨用量，不論是從經濟角度還是實際效果來看，選擇硫酸銨添加量0.4g更適宜。

2.5 固態培養酵母菌劑的生長曲線

圖4 氮源對酵母菌生長的影響Figure 4 Effects of inorganic nitrogen on the growth of yeast

圖5 酵母菌固態培養生長曲線Figure 5 The growth curve of yeast through solid－state ferment

由圖5可知，當取發酵12h樣品檢測時，酵母菌開始進入對數生長期。當發酵時間大于28h以后，培養基中的營養成分逐漸消耗，酵母菌的生長達到平穩期。為了生產更多的酵母菌，選擇26～28h終止發酵為宜。

2.6 正交試驗優化培養基成分結果分析

在單因素試驗基礎上，通過碳源、氮源和微量元素三因素正交試驗進一步優化培養基成分比例，正交試驗因素水平取值見表2，結果見表3。通過極差分析可知，對酵母菌生長影響因素從大到小依次為葡萄糖＞微量元素＞硫酸銨。

為了檢驗直觀分析中各因素不同水平差異是否顯著，進一步采用SPSS17.0對上述影響因素進行單因素方差分析即Tukey HSD多重比較，結果顯示葡萄糖水平1與水平3差異不顯著，但二者均與水平2差異極顯著，硫酸銨和微量元素各水平倆倆之間差異均不顯著，故選擇葡萄糖添加量4g、硫酸銨0.2g和微量元素1倍濃度，即A2B1CI為宜。將理論獲得的A2B1CI組合重復3次實驗，酵母菌數平均值（8.10±0.07）×108g－1，驗證了所得組合穩定可靠。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Levels of different variables of orthogonal experiments

表3 正交試驗結果與分析Table 3 The results and analyses of orthogonal experiment

2.7 中心組合試驗設計優化酵母菌培養條件

2.7.1 中心組合試驗設計及結果分析 按照1.4.8進行中心組合試驗優化酵母培養條件，結果見表4。

通過Design－expert 7.0對試驗數據進行回歸數據分析，建立二次回歸模型：

對模型數據進行方差分析，結果見表5。

由表5可知，回歸模型的F值55.85，“Prob＞F值”＜0.000 1，說明自變量與響應值的回歸關系顯著；失擬項的F值為2.24、“Prob＞F值”0.193 4，說明失擬項與純誤差差異不顯著。該模型的決定系數R2為0.981 2，調整后的決定系數為0.963 6，變異系數5.29%。決定系數介于0至1之間，決定系數越大，說明擬合方程的參考價值越大，模型擬合度越好；變異系數越小表示試驗可信度越高［8］。綜上可知，所建模型擬合度良好，可以理論推測因自變量變化而對響應值的影響。

由表5中F值可知，自變量因子貢獻率為D＞A＞B＞C，即培養溫度＞接種量＞厚度＞水分添加量，即培養溫度對菌種生長的影響最為顯著，接種量與厚度次之，水分添加量相對影響較小。模型中自變量之間的交互作用對響應值影響明顯的有AB（接種量與厚度）、AC（接種量與水分）、BC（厚度與水分）、CD（水分與溫度），其3D響應面交互作用見圖6～9。圖6～9中的酵母菌數量均隨著接種量、厚度、水分、發酵溫度呈現不同程度的先增加后降低趨勢。固態培養中酵母菌數的增長除了與營養成分相關外，還受氧氣、水分、溫度、初始菌種數量影響。酵母菌是好氧微生物，增殖需要足夠的氧氣，培養基厚度過大將影響氧的供應。酵母生長代謝需要一定的水分活度，水分含量越高，水分活度越大，酵母菌越易生長，但過多的水分會粘結固態培養基原料，導致氧氣傳質受阻，影響酵母菌生長繁殖。酵母菌生長有其最適溫度，在最適溫度前，隨著溫度升高，酵母菌生長加快，但當超過最適溫度時，則影響到酵母菌自身代謝而呈下降趨勢。從圖6～9可以看出，圖中兩兩因素均存在交互作用，但A（接種量）與C（水分）圖形最陡，交互作用最明顯。

表4 中心組合試驗設計及結果Table 4 Simplex－centroid design and response values

表5 中心組合試驗方差分析表Table 5 ANOVA for the reduced quadratic mixture models

圖6 接種量A與厚度B交互作用響應面三維圖示Figure 6 Combined effects of inoculum size A and thickness B on yeast count

通過Design－Expert 7.0軟件優化功能，得到模型的最優工藝參數和預測值：接種量3.51%，厚度1.29cm，水分36.53mL，溫度30.58℃，酵母菌數理論預測值1.227×109g－1。結合實際情況，最終優化參數為接種量3.50%，厚度1.3cm，水分添加量∶原料＝1∶1（m∶m），溫度30.6℃。

2.7.2 驗證實驗 在最佳培養條件下，重復5次固體培養，平板涂布計數酵母菌數量分別為1.23×109，1.35×109，1.10×109，1.40×109，1.25×109CFU/g，平均值為（1.27±0.12）×109CFU/g，與模型預測值1.23×109CFU/g接近，說明模型擬合性較好，可以用來理論預測培養的酵母活菌數值，該模型真實有效。

圖7 接種量A與水分添加量C交互作用響應面三維圖示Figure 7 Combined effects of inoculum size A and water addition C on yeast count

圖8 厚度B與水分添加量C交互作用響應面三維圖示Figure 8 Combined effects of thickness B and water addition C on yeast count

圖9 水分添加量C與溫度D交互作用響應面三維圖示Figure 9 Combined effects of water addition C and temperature D on yeast count

2.8 酵母菌劑的干制

按最佳方法固態培養28h酵母菌數折合絕干料均值（2.92±0.05）×109CFU/g。經真空40 ℃干燥8h后測得酵母菌活菌數折合絕干料（2.34±0.03）×109CFU/g，存活率80%。常壓45℃干燥24h后測得酵母菌活菌數折合絕干料（1.90±0.03）×109CFU/g，存活率65%。

3 結論

本試驗開展了以秸稈稻殼替代麩皮固態培養產朊假絲酵母的研究，利用產朊假絲酵母生長條件相對簡單的特點［9］，采用中心組合試驗設計及響應面分析法優化了酵母菌培養條件，發酵28h，酵母活菌計數（2.92±0.05）×109CFU/g絕干，試驗結果表明以秸稈稻殼替代麩皮固態培養產朊假絲酵母效果良好。

目前，以豆粕、麩皮為原料，利用酵母菌或復合菌種固態發酵提高原料蛋白含量的研究居多，而利用豆粕為主要原料制備活性酵母菌劑的報道較少。楊世平等［10］利用豆粕、麩皮、紅糖、酵母膏等培養沼澤生紅冬孢酵母，雖然所獲酵母活菌數較高，但成本偏高，發酵時間偏長。相比之下，本試驗更注重低成本和短時間，且原料更切合北方實際，具有潛在的應用價值。本試驗常壓干制，適合中小企業的應用；真空干燥，更適宜投資大的企業應用。

Mitchell等［11］認為固態發酵中存在傳熱傳質的問題，為此，在小試基礎上擴大生產應進一步摸索參數，可通過改善通風等因素，進一步提高供氧能力，以提升酵母活菌數量，攤薄生產成本，制備高效廉價的酵母益生菌劑。

1 胡學智，王俊.益生菌飼料的現狀、生產和應用效果［J］.中國微生態學雜志，2011，23（9）：861～864.

2 Melanie Le Bon，Helen E Davies，Caitriona Glynn，et al.Influence of probiotics on gut health in the weaned pig［J］.Livestock Science，2010（133）：179～181.

3 Francesca Gaggìa，Paola Mattarelli，Bruno Biavati.Probiotics and prebiotics in animal feeding for safe food production［J］.International Journal of Food Microbiology，2010（141）：S15～S28.

4 Choi J Y，Shinde P L，Ingale S L，et al.Evaluation of multi－microbe probiotics prepared by submerged liquid or solid substrate fermentation and antibiotics in weaning pigs［J］.Livestock Science，2011（138）：144～151.

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10 楊世平，劉慧玲，劉付文.沼澤生紅冬孢酵母的固體培養條件［J］.廣東海洋大學學報，2013，33（3）：22～26.

11 Gélinas P，Barrette J.Protein enrichment of potato processing waste through yeast fermentation［J］.Bioresource Technology，2007（98）：1 138～1 143.