超聲波輔助酸性緩沖液浸提木棗多糖的工藝優(yōu)化

李環(huán)宇 王 敏 李五霞 王曉琴 杜麗娟 冀曉龍（.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 700；.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 000）

木棗（Zizyphus jujubacv.Muzao）為鼠李科植物棗的果實(shí)，盛產(chǎn)于山西省呂梁地區(qū)和陜西省榆林地區(qū)，作為中草藥被廣泛使用。棗中富含糖類、皂苷、生物堿等多種生物活性物質(zhì)［1］。研究證實(shí)，棗多糖具有抗腫瘤［2］、抗氧化［3］、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力［4］等功效。

近年來，人們圍繞木棗多糖的抗小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞活性［5，6］展開了深入細(xì)致的研究，而木棗多糖的提取是對(duì)其功能進(jìn)行研究的基礎(chǔ)，目前專門針對(duì)木棗多糖提取工藝優(yōu)化的報(bào)道還比較少。酶法和水提法是木棗多糖提取的常規(guī)方法［5－7］，然而它們均存在耗能大、時(shí)間長(zhǎng)、效率低等缺點(diǎn)，亟需得到改進(jìn)優(yōu)化。楊春等［8］采用超聲波輔助傳統(tǒng)水浸提法提取木棗多糖，但該研究料液pH取值范圍局限于偏中性和堿性，沒有考慮酸性條件對(duì)多糖提取效果的影響。樊君等［9］研究發(fā)現(xiàn)以緩沖液作為提取劑較傳統(tǒng)水提法在動(dòng)力學(xué)上占優(yōu)勢(shì)，提取率也較高。所以本試驗(yàn)擬采用檸檬酸鹽緩沖液作為提取溶劑，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化木棗多糖的超聲波輔助提取工藝，旨在為木棗多糖的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木棗：陜西省榆林市佳縣；

檸檬酸、檸檬酸鈉：分析純，天津市博迪化工有限公司；

重蒸酚：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

濃硫酸：分析純，四川西隴化工有限公司；

乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗器：KQ－700DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：721型，上海光譜儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：SHZ－Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠；

低速離心機(jī)：KDC－40型，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；

精密pH計(jì)：HS－3C型，上海大普儀器有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：ZL－1型，上海醫(yī)療器械高等專科學(xué)校試驗(yàn)廠。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助檸檬酸鹽緩沖溶液浸提木棗多糖工藝

棗粉→加入檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液→超聲波輔助提取→離心→濃縮→脫蛋白→透析→濃縮→無水乙醇沉淀→凍干→木棗多糖

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）樣品預(yù)處理：選擇全熟期的木棗鮮果，剔除殘次果，清洗、瀝干后人工去核、60℃干燥處理，粉碎后過60目篩，再經(jīng)80%乙醇回流脫脂后風(fēng)干，得到的棗粉密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）緩沖溶液的配制：分別配制0.1mol/L的檸檬酸及檸檬酸鈉溶液，并按比例配成不同pH的緩沖液。

（3）離心：轉(zhuǎn)速為3 500r/min，時(shí)間10min。

（4）濃縮：采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，溫度45℃，將提取液處理至原體積的1/3。

（5）脫蛋白：采用傳統(tǒng)Sevag法脫蛋白，Sevag試劑（氯仿︰正丁醇＝4︰1）與提取液體積比為3︰1，重復(fù)操作5次。

（6）透析：采用透析袋（Mw＜3 500Da），流水透析48h。

（7）凍干：首先將樣液置于－60℃冰箱中預(yù)凍6h，然后置于冷凍干燥機(jī)處理24h。

1.3.3 多糖含量測(cè)定 采用苯酚—硫酸法［10］。

1.3.4 多糖提取率計(jì)算 為了便于操作，將提取液離心處理，直接測(cè)定上清液中的多糖含量。將其與棗粉質(zhì)量的比值定義為多糖提取率，并由此作為多糖提取效果的衡量標(biāo)準(zhǔn)［11］，多糖提取率按式（1）計(jì)算：

式中：

W——木棗多糖提取率，%；

ρ——葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——緩沖溶液的體積，mL；

n——測(cè)定時(shí)多糖液的稀釋倍數(shù)；m——脫脂后棗粉的質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱取2.0g棗粉置于小燒杯中，在其他條件相同的情況下，分別以檸檬酸鹽溶液pH、提取溫度、提取時(shí)間、超聲波功率、液料比為單因素進(jìn)行超聲輔助緩沖液浸提木棗多糖試驗(yàn)，以木棗多糖提取率為響應(yīng)值，逐個(gè)考察不同條件對(duì)提取效果的影響。

（1）檸檬酸鹽溶液pH值的選擇：設(shè)定超聲波功率420 W，提取時(shí)間50min，提取溫度50℃，液料比25︰1（V︰m），比較pH 分別為3.2，4.0，4.8，5.6，6.4時(shí)的多糖提取率。

（2）提取溫度的選擇：設(shè)定超聲波功率420W，提取時(shí)間50min，pH 5.6，液料比25︰1（V︰m），比較提取溫度分別為40，50，60，70，80℃時(shí)的多糖提取率。

（3）提取時(shí)間的選擇：設(shè)定超聲波功率420W，pH 5.6，提取溫度50℃，液料比25︰1（V︰m），比較提取時(shí)間分別為10，30，50，70，90min時(shí)的多糖提取率。

（4）超聲波功率的選擇：設(shè)定提取溫度50℃，提取時(shí)間50min，pH 5.6，液料比25︰1（V︰m），比較超聲波功率分別為280，350，420，490，560W 時(shí)的多糖提取率。

（5）液料比的選擇：設(shè)定超聲波功率420W，提取時(shí)間50min，提取溫度50℃，pH 5.6，比較液料比分別為10︰1，20︰1，30︰1，40︰1，50︰1（V︰m）時(shí)的多糖提取率。1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選對(duì)提取率影響顯著的單因素為變量，以多糖提取率為響應(yīng)值，采用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)檸檬酸—檸檬酸鹽緩沖液作為溶劑，超聲波輔助提取木棗多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.7 熱水浸提木棗多糖 以蒸餾水為提取劑，在液料比23.1︰1（V︰m），浸提溫度90℃，浸提時(shí)間180min條件下提取木棗多糖。其余操作均與超聲波輔助檸檬酸鹽緩沖溶液浸提木棗多糖一致。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2007和SPSS19對(duì)單因素試驗(yàn)中的各因素進(jìn)行比較分析。采用Design－Expert 8.05b進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 檸檬酸鹽溶液pH對(duì)多糖提取率的影響 由圖1可知，隨著pH值的升高，木棗多糖提取率呈先降低再升高而后又降低的趨勢(shì)；在pH 4出現(xiàn)最小值，在pH 5.6時(shí)有明顯最大值。這可能與某些特定基團(tuán)在特定pH條件下溶解性不同有關(guān)［12］；超聲波作用使某些酶被激活，這些酶參與的細(xì)胞生理化學(xué)過程，在pH 5.6時(shí)協(xié)同作用最強(qiáng)。由于pH對(duì)多糖提取率影響不顯著，所以緩沖溶液的pH不作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素，選擇固定pH為5.6進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 pH對(duì)多糖提取率的影響Figure 1 Effect of pH on extraction rate of polysaccharides

圖2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Figure 2 Effect of treatment temperature on extraction rate of polysaccharide

2.1.2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 由圖2可知，在40～70℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖的提取率升高，這可能是因?yàn)槌暡ㄒ鸬目栈饔卯a(chǎn)生的極大壓力造成生物細(xì)胞壁破裂，多糖的溶解度升高；超聲波作用激活的某些酶，促使細(xì)胞的新陳代謝過程加速，提取率升高［13］；在70℃達(dá)到峰值，繼續(xù)升高溫度，多糖提取率出現(xiàn)下降的情況，可能是溫度過高對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響；也可能是溫度過高使得某些酶活性降低，這些酶參與的生理化學(xué)反應(yīng)減弱，細(xì)胞新陳代謝過程減慢導(dǎo)致［14］。因此提取溫度應(yīng)控制在60～80℃。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 由圖3可知，提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取率越高。提取時(shí)間在30min以內(nèi)，提取率增高明顯，但是由30min延長(zhǎng)至90min多糖的提取率增加緩慢。這可能是由于短時(shí)間的超聲處理，介質(zhì)內(nèi)部的空化作用增強(qiáng)，溶劑中瞬間產(chǎn)生的空化氣泡迅速崩潰，溫度瞬間升高，棗粉迅速被擊碎［15］，多糖提取率快速升高。但是超聲波處理時(shí)間過長(zhǎng)就會(huì)產(chǎn)生劇烈的機(jī)械剪切作用和引起過多的熱量聚集，使多糖發(fā)生降解，多糖提取率隨之增長(zhǎng)緩慢［16］。所以從提高生產(chǎn)效率和節(jié)約成本的角度，選擇提取時(shí)間30min為宜。

2.1.4 超聲波功率對(duì)多糖提取率的影響 由圖4可知，隨著超聲波功率的增大，多糖提取率先升高而后逐漸降低，420 W時(shí)出現(xiàn)峰值。原因可能是：超聲波功率太低時(shí)，細(xì)胞壁的破碎程度低，多糖溶出慢；隨著功率的提高，產(chǎn)生的熱作用愈強(qiáng)，對(duì)液體顆粒的機(jī)械作用越明顯，多糖溶出速率變快［17］；但是超聲波功率太大時(shí)，一些能使目標(biāo)物降解的酶被充分釋放出來，造成多糖提取率降低［18］。綜合考慮，選擇超聲波功率350～490W。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Figure 3 Effect of treatment time on extraction rate of polysaccharides

圖4 超聲波功率對(duì)多糖提取率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharides

2.1.5 液料比對(duì)多糖提取率的影響 由圖5可知，液料比對(duì)多糖提取率有顯著影響，隨著液料比增大，木棗多糖提取率先逐漸增高而后逐漸降低，在20︰1（V︰m）時(shí)出現(xiàn)峰值。其原因可能是液料比為20︰1（V︰m）時(shí)，超聲波在液體中形成最大比例的有效的攪動(dòng)和流動(dòng)，達(dá)到最高的提取率。隨著液料比增大，樣品溶液的濃度降低，超聲波對(duì)懸浮于液體中的微粒的凝聚作用相對(duì)減弱，使得提取率降低［14］。考慮到后續(xù)處理工藝，液料比取10︰1～30︰1（V︰m）為宜。

圖5 液料比對(duì)多糖提取率的影響Figure 5 Effect of liquid－solid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選擇 根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定在pH 5.6、提取時(shí)間30min條件下，以提取溫度、液料比、超聲波功率為自變量，多糖提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)表2結(jié)果，利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到木棗多糖提取率對(duì)提取溫度、液料比和超聲功率的二次多項(xiàng)回歸方程為：

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

表2 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and result for response surface analysis

該回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，回歸模型（P＜0.01）達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)（P＝0.550 1＞0.1）影響不顯著，且相關(guān)系數(shù)R2＝0.996 2，表明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值高度相關(guān)。綜上所述，建立的回歸模型擬合度高，可用該模型較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的實(shí)際關(guān)系，可用該模型預(yù)測(cè)木棗多糖的提取工藝條件。從該回歸模型的方差分析還可以看出，3個(gè)因素對(duì)木棗多糖提取率的影響均不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。除了液料比和超聲功率的交互作用不顯著，其他一次項(xiàng)、交互項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)木棗多糖提取率的影響均達(dá)到顯著水平。各因素對(duì)多糖提取率的影響程度大小順序?yàn)椋阂毫媳龋境暡üβ剩咎崛囟取?/p>

根 據(jù)表2試驗(yàn)所得的響應(yīng)面圖見圖6～8。由圖6～8可知，液料比對(duì)木棗多糖提取率的影響極為顯著，其繪制的曲線最為陡峭；超聲波功率對(duì)木棗多糖的影響次之，而影響最小的則是提取溫度，與提取溫度相比，其曲線較為平滑一些。此外，圖6（b）和圖7（b）中的等高線呈明顯的橢圓形，說明提取溫度和液料比，提取溫度和超聲功率之間均具有非常顯著的交互作用。這些結(jié)果與表3的結(jié)果相一致。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

＊顯著（P＜0.05）；＊＊極顯著（P＜0.01）。

方差來源 自由度 平方和 均方 F值 P 值 顯著性X1 1 8.76 8.77 8.79 0.031 3＊X2 1 295.85 296.08 296.61 ＜0.000 1 ＊＊X3 1 9.50 9.51 9.52 0.027 2 ＊X1X2 1 197.26 197.30 197.65 ＜0.000 1 ＊＊X1X3 1 21.07 21.00 21.04 0.005 8 ＊＊X2X3 1 6.50 6.49 6.51 0.050 9 X12 1 335.72 335.78 336.38 ＜0.000 1 ＊＊X22 1 475.69 475.47 476.32 ＜0.000 1 ＊＊X32 1 22.22 22.16 22.20 0.005 2 ＊＊模型 9 1 296.79 144.09 144.35 ＜0.000 1 ＊＊誤差項(xiàng) 5 4.98 1.00失擬項(xiàng) 3 2.92 0.98 0.95 0.550 1純誤差 2 2.06 1.03所有項(xiàng)14 1 301.76

圖6 提取溫度和液料比交互作用對(duì)木棗多糖的提取率影響的響應(yīng)面圖Figure 6 Response surface plots for the interaction effects between extraction temperature and liquid－solid ratio on the polysaccharides extraction ratio of Zizyphus jujube cv.Muzao

圖7 提取溫度和超聲功率交互作用對(duì)木棗多糖的提取率影響的響應(yīng)面圖Figure 7 Response surface plots for the interaction effects between extraction temperature and ultrasonic power on the polysaccharides extraction ratio of Zizyphus jujube cv.Muzao

圖8 液料比和超聲功率交互作用對(duì)木棗多糖的提取率影響的響應(yīng)面圖Figure 8 Response surface plots for the interaction effects between liquid－solid ratio and ultrasonic power on the polysaccharides extraction ratio of Zizyphus jujube cv.Muzao

2.2.3 模型驗(yàn)證 通過Design－Expert 8.05b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析確定各因素的最佳取值，Y的最大估計(jì)值67.63%，穩(wěn)定點(diǎn)（X1，X2，X3）的編碼值為（－0.16，0.31，－0.06）。與之對(duì)應(yīng)的提取溫度68.4℃、液料比23.1︰1（V︰m）、超聲波功率415.8W。考慮實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為超聲波功率420W，提取溫度68℃，液料比23.1︰1（V︰m），pH 5.6，時(shí)間30min，并進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的多糖提取率為（67.38±0.16）%，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差＜1%，說明回歸方程擬合度高。

2.3 不同提取方法的比較

由表4可知，與熱水浸提法相比，超聲波輔助檸檬酸鹽緩沖溶液浸提木棗多糖可使多糖提取率提高66.41%，效果十分顯著。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，利用Box－Behnken響應(yīng)面法對(duì)木棗多糖的超聲波輔助酸性緩沖液浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。結(jié)果表明，其提取工藝條件為：以pH為5.6的檸檬酸鹽緩沖溶液為提取劑，液料比23.1︰1（V︰m），超聲波功率420W，提取溫度68℃，時(shí)間30min。該條件下木棗多糖的實(shí)測(cè)提取率為（67.38±0.16）%。與傳統(tǒng)熱水提取法相比，超聲波輔助酸性緩沖溶液浸提木棗多糖能顯著縮短提取時(shí)間，降低提取溫度，提高多糖提取率，可為木棗的開發(fā)利用和木棗多糖的研究提供依據(jù)，但是關(guān)于此方法提取的木棗多糖的生物活性還有待于進(jìn)一步的研究。

表4 不同提取方法的比較Table 4 Comparison of different extraction methods

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