探頭式超聲乳化催化脂肪酶TLIM水解茶葉籽油工藝優(yōu)化

向小樂 余 佶 楊萬根 麻成金（1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 47000；.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000）

脂肪酶催化油脂水解因具有反應(yīng)條件溫和、效率高、產(chǎn)物雜質(zhì)少等優(yōu)勢而成為制備甘油二酯、甘油單脂、脂肪酸、結(jié)構(gòu)脂質(zhì)及油脂深加工的有效手段［1，2］。超聲波的空化、乳化效應(yīng)較強，能降低界面張力和溶液黏度、增加非均相之間接觸界面，從而促進油脂酶解［3，4］。

近年來，國內(nèi)外對茶葉籽油的研究主要集中于提取精煉工藝、脂肪酸組成［5］、理化特性、保健功能［6］等方面，暫無運用探頭式超聲波對油脂酶解工藝進行強化處理的文獻報道。本試驗在前期研究［7］的基礎(chǔ)上，擬采用Box－Benhnken試驗設(shè)計，對探頭式超聲波耦合磁力攪拌協(xié)同輔助脂肪酶TLIM，催化茶葉籽油水解工藝條件進行優(yōu)化，以期進一步為茶葉籽油的綜合加工利用及脂肪酶TLIM的酶學(xué)性質(zhì)研究提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉籽油：由湖南省古丈縣茶葉基地提供茶葉籽，機械壓榨制油；

脂肪酶：TLIM（250IU/g），諾維信生物技術(shù)有限公司；

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、無水乙醇等：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

超聲波細(xì)胞破碎機：JY92－IIDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

雙數(shù)顯恒溫測速磁力攪拌器：85－2A型，金壇市白塔新寶儀器廠；

電子天平：FA2004型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶葉籽油酶解 在文獻［7］的基礎(chǔ)上加以改進，將所需配比的茶葉籽油、TLIM脂肪酶及pH緩沖液于30mL反應(yīng)釜中混勻，調(diào)節(jié)水浴溫度、磁力攪拌轉(zhuǎn)速，設(shè)置超聲波發(fā)生器參數(shù)，開始反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，直接測定茶葉籽油酶解產(chǎn)物——油水乳化液酸值。

1.2.2 水解率計算 參照 GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》測定油水乳化液酸值，參照GB/T 5534—2008《動植物油脂皂化值的測定》測定茶葉籽油皂化值。酸值［8］及水解率［2，3］分別按式（1）和（2）計算：

式中：

AV——乳化油樣酸值，mg KOH/g；

CKOH——氫氧化鉀濃度，mol/L；

V滴——滴定油樣所耗氫氧化鉀，mL；

V空——對照試驗所耗氫氧化鉀，mL；

MKOH——KOH 摩爾質(zhì)量，g/mol；

m樣——所取乳化液質(zhì)量，g；

fo——乳化液中油所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：

DH——茶葉籽油水解率，%；

SV——皂化值，mg KOH/g；

AV0、AVt——分別表示酶解前后酸值，mg KOH/g。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

（1）超聲波功率：固定油水比1︰1.5（m︰V），攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，脂肪酶TLIM濃度1.0%（油重），溫度50℃，緩沖液初始pH 6.5，時間2h，研究超聲波功率（20，80，140，200，260，320，380W，空占比＝1s︰2s）對茶葉籽油酶解的影響。

（2）攪拌轉(zhuǎn)速：固定油水比1︰1.5（m︰V），超聲波功率320W，脂肪酶TLIM濃度1%，溫度50℃，pH 6.5，時間2h，研究攪拌轉(zhuǎn)速（200，400，600，800，1 000，1 200r/min）對茶葉籽油酶解率的影響。

（3）酶解溫度：固定油水比1︰1.5（m︰V），超聲波功率320W，轉(zhuǎn)速800r/min，脂肪酶 TLIM 濃度1%，pH 6.5，時間2h，研究水浴溫度（35，40，45，50，55，60，65℃）對茶葉籽油酶解率的影響。

（4）脂肪酶TLIM濃度：固定油水比1︰1.5（m︰V），超聲波功率320W，轉(zhuǎn)速800r/min，溫度50℃，pH 6.5，時間2h，研究脂肪酶 TLIM 濃度（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%）對茶葉籽油酶解率的影響。

（5）緩沖液初始pH：固定油水比1︰1.5（m︰V），超聲波功率320W，轉(zhuǎn)速800r/min，溫度50℃，脂肪酶濃度2.5%，時間2h，研究緩沖液初始pH（6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5）對茶葉籽油酶解率的影響。

（6）酶解時間：固定油水比1︰1.5（m︰V），超聲波功率320W，轉(zhuǎn)速800r/min，溫度50℃，脂肪酶TLIM濃度2.5%，pH 8.5，研究酶解時間（0，2，4，6，8，10，12，14h）對茶葉籽油酶解率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計 本試驗在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以茶葉籽油水解率為響應(yīng)值，運用 minitab.16中Box－Benhnken設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面分析試驗對超聲波輔助脂肪酶TLIM水解茶葉籽油工藝進行優(yōu)化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗數(shù)據(jù)使用Origin 8軟件進行分析，響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)使用minitab.16軟件進行分析，每組試驗設(shè)計3個平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲波功率對茶葉籽油水解率的影響 由圖1可知，茶葉籽油水解率隨超聲波功率的增加先呈指數(shù)型增長而后變緩，這與馬歌麗等［9］報道的超聲波對脂肪酶酶學(xué)特性的影響所得結(jié)論相似。此結(jié)果表明，適當(dāng)功率的超聲波強化能促進脂肪酶催化茶葉籽油水解，其原因可能是超聲波的乳化效應(yīng)能增大反應(yīng)底物油水之間的接觸面積、空化效應(yīng)能促使產(chǎn)物釋放［3］。因此，綜合考慮超聲波的催化效率及儀器的使用壽命，選擇超聲波功率為320W為宜。

圖1 超聲波功率對茶葉籽油水解率的影響Figure 1 Effect of power of ultrasonic on tea seed hydrolysis

圖2 磁力攪拌轉(zhuǎn)速對茶葉籽油水解的影響Figure 2 Effect of speed of magnetic stirring on Tea seed hydrolysis

2.1.2 磁力攪拌轉(zhuǎn)速對茶葉籽油水解率的影響 由圖2可知，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速小于800r/min時，茶葉籽油水解率隨轉(zhuǎn)速增加而增大，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速大于1 000r/min時其水解率反而有所降低。其原因可能是增大攪拌轉(zhuǎn)速能有效加大油水接觸界面，而轉(zhuǎn)速過高又可能破壞酶蛋白結(jié)構(gòu)［10］；此外，也可能是由于當(dāng)轉(zhuǎn)速高于1 000r/min后，磁力攪拌的磁子不穩(wěn)定而導(dǎo)致茶葉籽油水解率降低。因此，選擇磁力攪拌轉(zhuǎn)速在800r/min左右為宜。

2.1.3 酶解溫度對茶葉籽油水解率的影響 由圖3可知，在該酶解體系中，脂肪酶TLIM催化茶葉籽油水解反應(yīng)的最適溫度為50℃，這與向小樂等［7］、高巍等［11］所得結(jié)論相近。因此，選擇酶解溫度在50℃左右為宜。

圖3 酶解溫度對茶葉籽油水解率的影響Figure 3 Effect of bath temperature on tea seed hydrolysis

2.1.4 脂肪酶TLIM濃度對茶葉籽油水解率的影響 由圖4可知，在該試驗范圍內(nèi)，茶葉籽油水解率隨脂肪酶TLIM濃度的增加先急速增長，當(dāng)其濃度達2.5%后水解增長放緩，說明脂肪酶基本飽和。與文獻［7］相比，此酶解體系的脂肪酶濃度稍低于機械攪拌聯(lián)合超聲波震浴酶解體系的飽和濃度，說明探頭式超聲波乳化促進了脂肪酶溶解及其與油水乳化液的結(jié)合。因此，綜合考慮水解效率及脂肪酶成本，選擇脂肪酶TLIM濃度在2.5%左右為宜。

圖4 脂肪酶TLIM濃度對茶葉籽油水解率的影響Figure 4 Effect of concentration of lipase TLIM on tea seed hydrolysis

2.1.5 pH對茶葉籽油水解率的影響 酶促反應(yīng)最適pH由酶分子本質(zhì)特性及外界環(huán)境酸堿度共同決定，即反應(yīng)體系中酸堿度可通過改變酶分子表面電荷及酶蛋白構(gòu)象來影響酶的催化活性［12，13］。由圖5可知，脂肪酶TLIM催化茶葉籽油水解反應(yīng)的最適pH為8.5，說明TLIM是一種堿性脂肪酶，與向小樂等［7］所得結(jié)論基本一致。

圖5 緩沖液初始pH對茶葉籽油水解率的影響Figure 5 Effect of initial pH of buffer on tea seed hydrolysis

2.1.6 酶解時間對茶葉籽油水解率的影響 由圖6可知，在該酶解體系中，反應(yīng)8h左右即可使水解率達70%左右（理論水解率為66.67%，水解率高于66.67%的原因可能是2位上脂肪酸異構(gòu)到1，3位來參與反應(yīng)［14，15］，因此水解速率增長大幅下降）。與文獻［7］中機械攪拌聯(lián)合超聲波震浴輔助茶葉籽油酶解17h方可使水解率達到70%相比，探頭式超聲波乳化工藝的水解效率顯著提高。因此，綜合考慮水解程度及酶解效率，選擇酶解時間為8h為宜。

圖6 酶解時間對茶葉籽油水解率的影響Figure 6 Effect of reaction time on tea seed hydrolysis

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 Box－Benhnken響應(yīng)面試驗設(shè)計因素及水平見表1，結(jié)果及預(yù)測值見表2、方差分析見表3。運用軟件minitab.16對表2中試驗結(jié)果進行回歸分析，得預(yù)測模型方程：

表1 Box－Benhnken設(shè)計水平編碼表Table 1 Variables and coded levels used in the B－BD

表2 Box－Benhnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box－Benhnken Design

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由表3可知，所建模型P＜0.05（顯著），相關(guān)系數(shù)R2＝0.944 8，決定系數(shù)（調(diào)整相關(guān)系數(shù)）＝0.845 3，失擬項P＝0.096＞0.05（不顯著），說明該模型擬合程度較高，能在84.53%的變更范圍內(nèi)解釋茶葉籽油的酶解情況［16］；試驗因子對茶葉籽油酶解的影響順序為TLIM脂肪酶濃度＞溫度＞轉(zhuǎn)速。

2.2.2 因素交互作用 根據(jù)方差分析結(jié)果，利用軟件minitab.16對茶葉籽油酶解影響較大的兩交互因子進行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖7、8。響應(yīng)曲面的陡度和等高線與坐標(biāo)軸交點數(shù)能在一定程度上反映試驗因子對響應(yīng)值的貢獻大小。

由圖7、8可知，試驗因素曲面陡度及其等高線與坐標(biāo)軸的交點數(shù)大小順序為B＞A＞C，即說明各試驗因子對超聲波輔助TLIM脂肪酶催化茶葉籽油水解影響的大小順序：脂肪酶TLIM濃度＞溫度＞轉(zhuǎn)速，此結(jié)論與方差分析結(jié)果一致。綜合考慮反應(yīng)效率和經(jīng)濟效益對茶葉籽油酶解工藝進行優(yōu)化，結(jié)果見2.2.3。

2.2.3 優(yōu)化工藝確定和驗證實驗 運用軟件minitab.16中響應(yīng)優(yōu)化器對A、B、C三因素進行尋優(yōu)處理，結(jié)果見圖9。

圖7 A—B因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Figure 7 Response surface and contour plot for the interaction of A and B

圖8 A—C因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Figure 8 Response surface and contour plot for the interaction of A and C

圖9 響應(yīng)因子優(yōu)化圖Figure 9 optimizingfigure of response test factor

由圖9可知，超聲波耦合磁力攪拌協(xié)同輔助脂肪酶TLIM水解茶葉籽油的優(yōu)化工藝為：A＝0.090 9，B＝1.000 0，C＝0.212 1，經(jīng)編碼公式轉(zhuǎn)換為實際參數(shù)值：溫度為50.45℃，TLIM脂肪酶濃度為3.0%，轉(zhuǎn)速為842.42r/min。考慮實際情況，選取：溫度50.5℃，TLIM脂肪酶濃度3.0%，轉(zhuǎn)速840r/min進行3次平行驗證實驗，測得茶葉籽油的平均水解率為73%，與模型預(yù)測值73.38%的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52%。說明在本試驗范圍內(nèi)，所建模型擬合程度較好，預(yù)測能力較強。

3 結(jié)論

探頭式超聲波耦合磁力攪拌協(xié)同輔助脂肪酶TLIM催化茶葉籽油水解的優(yōu)化工藝條件為：超聲波功率320W，攪拌轉(zhuǎn)速840r/min，酶解溫度50.5℃，脂肪酶TLIM濃度3.0%，緩沖液初始pH 8.5，酶解時間8h，在該條件下茶葉籽油水解率約達73%。與機械攪拌聯(lián)合超聲波震浴（清洗器）酶解體系［7］相比，此法酶解8h左右即可完成脂肪酶TLIM催化茶葉籽油水解的主體反應(yīng)（選擇性水解1，3位上脂肪酸，理論水解率67%），催化效率高，操作簡便易行。但該法酶解增大了反應(yīng)產(chǎn)物——油水乳化混合液的分離難度。

1 徐懷德，唐菊，劉立芳.豬胰脂肪酶水解花椒籽油動力學(xué)及條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2010，31（15）：55～59.

2 甘爭艷.無溶劑及微乳液體系中脂肪酶催化油脂水解反應(yīng)研究［D］.烏魯木齊：新疆大學(xué)，2006.

3 劉亞軒.超聲波作用下脂肪酶催化豆油水解反應(yīng)的研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2008.

4 Ramachandran K B，Al－Zuhair S，F(xiàn)ong C S，et al.Kinetic study on hydrolysis of oils by lipase with ultrasonic emulsification［J］.Biochemical Engineering Journal，2006，32（1）：19～24.

5 賴錫湖，黃卓，李堅，等.超臨界CO2萃取茶葉籽油及其成分分析［J］.食品與機械，2011，27（2）：38～40.

6 劉國艷，王興國，金青哲，等.一種新資源油脂——茶葉籽油的研究現(xiàn)狀分析［J］.中國油脂，2013，38（8）：84～88.

7 向小樂，黃群，楊萬根.超聲波輔助脂肪酶水解茶葉籽油條件的優(yōu)化與動力學(xué)研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（2）：141～146.

8 Rooneya D，Weatherley L R.The effect of reaction conditions upon lipase catalysed hydrolysis of high oleate sunflower oil in a stirred liquid－liquid reactor［J］.Process Biochemistry，2001，36（10）：947～953.

9 馬歌麗，董文惠，張勇，等.超聲波對脂肪酶酶學(xué)特性的影響［J］.現(xiàn)代食品科技，2007，23（8）：17～19.

10 Aditi Sharma，Satyendra P Chaurasia，Ajay K Dalai.Enzymatic hydrolysis of cod liver oil for the fatty acids Production［J］.Catalysis Today，2013，207（30）：93～100.

11 高巍，楊立昌，洪鯤，等.TLIM脂肪酶對油脂水解特性的研究［J］.糧油加工，2010（4）：14～18.

12 張玉霞.單一AOT微乳液與AOT/TritonX－100混合微乳液體系中假絲酵母脂肪酶催化蓖麻油水解的研究［D］.蘭州：蘭州大學(xué)，2007.

13 Sonsoles Piera－Velazaquez，F(xiàn)rutos Maruenda－Egea，Eduardo Cadenas.The dependence of a halophilic malate dehydrogenase on Wo and surfactant concentration in reverse micelles［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2001，13（1～3）：49～55.

14 周位，楊江科，黃瑛，等.復(fù)合脂肪酶催化生物柴油的初步研究［J］.生物加工過程，2007，5（3）：20～26.

15 宋坷珂，汪勇，王麗麗，等.磷脂酶 A1（Lecitase Ultra）催化水解油脂機理研究（Ⅱ）—立體選擇性及水解進程［J］.中國油脂，2009，34（11）：35～40.

16 吳瓊，代永剛，鄒險峰，等.響應(yīng)面法優(yōu)化脂肪酶水解葵花油工藝［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34（6）：60～62.