油茶葉中黃酮的超聲輔助提取及其抗氧化活性研究

曹清明 鄔靖宇 鐘海雁 包莉圓 孫亞娟（.中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 40004；2.經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 40004）

油茶葉富含黃酮類化合物［1，2］，其黃酮類物質的母核主要為山奈酚［3］和槲皮素［1，3］，且與之結合的糖基主要是鼠李糖、半乳糖和葡萄糖［3］。油茶葉黃酮提取物具有抗氧化［4］、抑菌［5，6］、防腐保鮮［7］和降血脂［8］等功能作用。每年4、5月間油茶樹打葉產生大量的落葉，但目前此類資源仍未得到有效利用。從油茶葉中提取黃酮類化合物，可提高油茶資源的綜合利用率。

超聲輔助提取可在較低溫度下高效率地萃取物質中的活性成分［9，10］，用超聲輔助從油茶葉中提取黃酮的研究也有報道，但往往存在溶劑消耗量大、耗時、耗能等缺點。如：張建良等［1］利用甲醇從油茶葉中提取得到了黃酮；李姣娟等［4］以體積分數為60%的乙醇為提取劑，在固液比1︰20（m︰V），提取溫度80℃，提取2次，每次提取2h的條件下提取油茶葉黃酮，其得率為48.7mg RE/g；肖新生等［11］采用超聲波輔助萃取法，在乙醇濃度60%，提取時間20min，料液比1︰20（m︰V），超聲波功率450W的條件下得到的粗黃酮得率為4.17%；黃陳陳［6］選用超聲波輔助提取與有機溶劑萃取相結合的方法，采用正交試驗方法確定了油茶葉黃酮最佳提取條件，即在料液比1︰20（m︰V）時以75%乙醇為提取劑，在75℃溫度下萃取70min，黃酮得率為46.82mg RE/g。李姣娟等［4］的方法盡管得率最高，但其所用的時間長，提取溫度高；肖新生等［11］的方法得率較低；黃陳陳［6］的提取方法使用有機溶劑乙醇濃度大，為了克服上述不足，本研究擬對油茶葉黃酮的超聲輔助提取工藝進行優化，并對其提取物進行抗氧化能力試驗，旨為油茶葉的綜合開發利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料

新鮮油茶葉：采自湖南省天際嶺國家森林公園，由中南林業科技大學譚曉鳳教授鑒定為普通油茶（Camellia Oleif－era Abel.）。

1.1.2 試劑蘆丁標準品：HPLC純，純度＞97%，美國Sigma公司；1，1－二苯基－2－苦味?；诫拢―PPH）：HPLC純，美國Sigma公司；

2 ，2－聯 氮－二 （3－乙 基－苯 并 噻 唑－6－磺 酸 ）二 銨 鹽（ABTS）：美國Sigma公司。

1.1.3 儀器

721可見分光光計，A－1402017型，上海菁華科技儀器有限公司；

旋風式樣品磨：FOSS CT410型，蘇州安創儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：R－205B型，上海申勝儀器公司；

恒溫水浴鍋：DZKW－S－8型，北京市永光明醫療儀器廠；

超聲波清洗器：AS10200A型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2 油茶葉黃酮類化合物的提取

1.2.1 蘆丁標準曲線的確定 準確稱取0.007 2g蘆丁標準品，用50%乙醇溶解后轉移至50mL棕色容量瓶，用50%乙醇定容，即得144μg/mL的蘆丁標準母液。分別取蘆丁母液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL至5個25mL棕色容量瓶中，分別向容量瓶中加入質量分數為5%的NaNO20.6mL，搖勻后靜置6min，往各容量瓶中加入質量分數為10%的Al（NO3）30.6mL，搖勻后放置6min，加入1mol/L的 NaOH溶液8mL，用50%乙醇溶液定容，得蘆丁標準溶液濃度依次為11.52，23.04，34.56，46.08，57.60μg/mL。將配好的蘆丁標準溶液靜置15min，于510nm波長處測吸光值，并以50%乙醇水溶液做參比。根據吸光值繪制標準曲線。

1.2.2 油茶葉黃酮類物質的提取 稱取5.000g自然陰干的油茶葉粉末，加入一定體積的乙醇—水提取液。放入超聲波清洗機（功率為300W）內進行超聲輔助提取。提取一定時間后用定性濾紙過濾獲得上清液，重復提取若干次，合并所得上清液，濃縮定容至250mL即為黃酮提取溶液。

1.2.3 油茶葉中黃酮提取率的測定 取1.2.2獲得的黃酮提取液5mL于25mL容量瓶中，加質量分數為5%的NaNO20.6mL，搖勻后靜置6min，加入質量分數為10%的Al（NO3）30.6mL，搖勻后放置 6min，加入 1mol/L 的NaOH溶液8mL，用50%乙醇溶液定容，15min后于510 nm處測定吸光值。以50%乙醇水溶液做參比。根據標準曲線、稀釋倍數、樣品質量得到總黃酮提取量，并按式（1）計算黃酮類化合物的提取量。黃酮提取量以與等量蘆丁標準品（rutin equivalent，RE）相當的生物活性計。

式中：

P——油茶葉黃酮的提取量，mg RE/g；

C——通過標準曲線得到的黃酮濃度，μg/mL；

V——黃酮提取物的體積，mL；

n——稀釋倍數；

m——油茶葉樣品的質量，g。

1.3 油茶葉黃酮類物質提取工藝的優化

根據前期單因素試驗的結果，選擇超聲處理時間、料液比、提取溫度、乙醇濃度為試驗因素，以黃酮提取量作為優化指標，進行L9（34）的正交試驗。正交試驗因素水平見表1。

表1 因素水平Table 1 Levels of factors

1.4 油茶葉中黃酮類物質的抗氧化能力

以優化工藝得到的提取液作為原液，按其黃酮含量用蒸餾水稀釋成10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μg RE/mL，將不同濃度的黃酮提取液進行DPPH·和ABTS＋自由基清除試驗；按其黃酮含量用蒸餾水稀釋成100，200，300，400，500，600，700，800，900，1 000μg RE/mL，將不同濃度的黃酮提取液進行羥自由基清除試驗。

1.4.1 DPPH·清除能力 根據文獻［12］的方法，略作修改：精密稱取19.716mg DPPH粉末，用無水乙醇配制成1×10－4mol/L的DPPH·乙醇溶液。量取不同濃度的黃酮樣液1mL，加入DPPH·乙醇溶液3mL，混勻，室溫下避光15 min，以無水乙醇調零，517nm處測量吸光值為A1，以無水乙醇代替黃酮樣液測定吸光值為A0，無水乙醇代替D PPH·乙醇溶液測定吸光值為A2。按上述方法測定相同濃度的沒食子酸、BHT、Vc的DPPH·清除率，比較提取樣液與BHT、Vc的DPPH·清除能力。每組試驗重復3次。DPPH·清除率按式（2）計算：

式中：

C——DPPH·清除率，%；

A1——各濃度黃酮提取液與DPPH·乙醇溶液反應后的吸光值；

A2——無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液反應后的吸光值；

A0——無水乙醇代替黃酮樣液與DPPH·乙醇溶液反應后的吸光值。

1.4.2 ABTS＋清除能力 根據文獻［13］的方法，略作修改：將7mmol/L的 ABTS和2.45mmol/L的過硫酸鉀溶液，按體積比1︰2混合，在4℃冰箱中靜置16～18h，制得ABTS＋儲備液。將儲備液用無水乙醇稀釋成在734nm波長處吸光值為0.700±0.020的工作液。準確量取0.1mL不同濃度（10～100μg/mL）的黃酮樣液于10mL試管中，同時向試管中加入ABTS＋工作液2.9mL，常溫下避光反應6 min后，測定734nm波長處的吸光值A1；蒸餾水代替黃酮樣液，測定吸光值A0；蒸餾水代替ABTS＋工作液，測定吸光值A2。用上述方法測定相同濃度的BHT、Vc的ABTS＋清除率，比較油茶葉提取液與沒食子酸、BHT、Vc的ABTS＋清除能力。每組試驗重復3次。ABTS＋清除率按式（3）計算：

式中：

C——ABTS＋清除率，%；

A1——各濃度黃酮提取液與ABTS＋工作液反應后的吸光值；

A2——無水乙醇代替ABTS＋工作液反應后的吸光值；

A0——無水乙醇代替黃酮樣液與ABTS＋工作液反應后的吸光值。

1.4.3 ·OH清除能力 用移液槍移取6mmol/L的硫酸亞鐵溶液和6mmol/L的過氧化氫溶液各1mL于離心管中，將兩者混合均勻后向混合溶液中加入1mL不同濃度的提取液（0.1～1.0mg/mL），靜置10min，加入6mmol/L水楊酸溶液1mL，37℃水浴震蕩30min，4 000r/min離心10 min，得上清液，將上清液于510nm波長處測定吸光值A1；蒸餾水代替樣品液，測定吸光值A0；蒸餾水代替水楊酸，測定吸光值A2。用上述方法測定相同濃度的蘆丁、BHT、Vc的·OH清除率，比較油茶葉提取液與BHT、Vc的·OH清除能力。每組試驗重復3次。·OH清除率按式（4）計算：

式中：

C——·OH清除率，%；

A1——各濃度黃酮提取液與·OH反應后的吸光值；A2——無水乙醇代替水楊酸反應后的吸光值；

A0——無水乙醇代替黃酮樣液與·OH反應后的吸光值。

1.5 數據分析與統計

試驗數據的統計，回歸方程的擬合用Excel完成，方差分析使用SPSS 17.0。以P＜0.05作為顯著性判斷標準，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準工作曲線的確定

圖1 蘆丁標準曲線Figure 1 Rutin standard curve

蘆丁的濃度與吸光度值的標準曲線見圖1，回歸方程為y＝0.014 6x，R2＝0.999 1（x為總黃酮濃度，μg/mL；y為吸光值），蘆丁標準溶液在0.00～57.60μg/mL濃度范圍內，濃度與吸光值存在良好線性關系，該線性方程可以用來測定提取液中黃酮類化合物的含量。

2.2 正交試驗結果與分析

選擇超聲處理時間、料液比、提取溫度、乙醇濃度4個因素進行正交試驗優化，結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiments（n＝3）

由表2可知，在9次正交試驗中以第5次試驗中黃酮提取量最多，為46.93mg RE/g，第8次試驗黃酮提取量最少，為39.08mg RE/g。直觀分析表明超聲處理時間、料液比、提取溫度和乙醇濃度4個因素對黃酮提取量的影響大小次序為：乙醇濃度＞超聲處理時間＞料液比＞提取溫度。綜合各因素的k值和極差R比較，得出超聲輔助提取法的最佳工藝條件為A2B2C2D1，即超聲處理時間30min，料液比1∶20（m︰V），提取溫度70℃，乙醇濃度50%。

表3 方差分析結果Table 3 The results of variance analysis

由表3可知，超聲處理時間、料液比和乙醇濃度3個因素的不同水平對黃酮提取率的影響極顯著（P＜0.01），提取溫度對黃酮提取率的影響顯著（P＜0.05）。由表4可知，選擇超聲處理時間30min，料液比1︰20（m︰V），提取溫度70℃，乙醇濃度50%，可取得最佳提取效果。綜合考慮各因素，得出超聲輔助提取法上的最佳工藝條件為A2B2C2D1。比較正交試驗的極差分析和方差分析結果，可以得出相同的結論。

表4 因素各水平結果的多重比較Table 4 Multiple comparison results of different levels of Factors

表4 因素各水平結果的多重比較Table 4 Multiple comparison results of different levels of Factors

同列不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。

A/min黃酮提取率/（mg RE·g－1）B（m︰V）黃酮提取率/（mg RE·g－1）C/℃黃酮提取率/（mg RE·g－1）D/%黃酮提取率/（mg RE·g－1）20 42.14±2.43b 30 44.45±2.68a 40 41.15±1.99c 1︰15 41.47±0.93c 1︰20 43.56±3.51a 1︰25 42.70±2.79b 65 42.33±2.80b 70 43.04±1.69a 75 42.37±3.53b 50 44.28±2.11a 60 43.69±2.13b 70 39.77±1.00c

對選擇的最佳提取方案A2B2C2D1，即超聲處理時間30 min，料液比1︰20（m︰V），提取溫度70℃，乙醇濃度50%，進行驗證實驗，采用 NaNO2—Al（NO3）3—NaOH 比色法測定黃酮含量，獲得的提取率為47.01mg RE/g。結果與正交試驗方案中的試驗號為5的結果（46.93mg RE/g）基本一致，說明正交試驗所獲最佳方案的準確性。

2.3 油茶葉黃酮的抗氧化能力

2.3.1 DPPH·清除能力 DPPH·具有自由電子，有強氧化性，易被抗氧化劑還原。由圖2可知，提取物、VC均具有很強的DPPH·清除能力，BHT的清除能力相對較差。前兩者在較低濃度時清除率就達到90%，超過該濃度（約30μg/mL）后DPPH·清除率變化趨于平衡。選用濃度為0，10，20，30 μg/mL 4個點進行線性擬合，由Excel擬合出油茶葉黃酮濃度與DPPH·清除率的回歸擬合方程為y＝3.307 6x（R2＝0.913 5），將y＝50代入該方程，求得半數自由基清除值（IC50）為15.12μg/mL。

圖2 不同濃度的提取物、BHT、VC的DPPH·清除率Figure 2 The DPPH free racial－scavenging capacity of Extract，BHT ＆ VCin different concentrations

2.3.2 ABTS＋清除能力 ABTS＋可以與抗氧化劑反應褪去顏色，試驗通過向反應器中加入不同濃度的提取物、VC及BHT，根據反應器中顏色的減弱情況來計算自由基的清除率。由圖3可知，樣品、VC及BHT均具有ABTS＋清除能力，且其清除能力與濃度呈正相關。相同濃度的3種物質中BHT清除率最低。在整個試驗濃度范圍內油茶葉提取物的ABTS＋清除率均高于BHT的清除率，但低于VC的清除率。由Excel擬合出油茶葉提取物濃度與ABTS＋清除率的回歸擬合方程為y＝2.364x（R2＝0.989），將y＝50代入該方程，求得半數自由基清除值（IC50）為21.15μg/mL。

圖3 不同濃度提取物、BHT、VC的ABTS＋清除率Figure 3 The ABTS free radical－scavenging capacity of Extract，BHT ＆ VCin different concentrations

2.3.3 ·OH清除能力 H2O2能與Fe2＋發生Fenton反應生成活性很強的·OH，·OH能殺死紅細胞，降解DNA、細胞膜和多糖化合物，對人體有一定的危害作用。本試驗以VC及BHT對參照探究油茶葉黃酮提取物對該自由基的清除效果。由圖4可知，3種物質都具有一定的·OH清除能力，隨著濃度的增加，·OH清除率增加，當濃度達到某一值后清除率趨于穩定。各個濃度提取樣品的·OH清除率都比BHT高，與VC相當。由Excel擬合出油茶葉黃酮濃度與·OH清除率的回歸擬合方程為y＝0.122x（R2＝0.944），將y＝50代入該方程，求得半數自由基清除值（IC50）為410.00μg/mL。

圖4 不同濃度提取物、BHT、VC清除羥自由基能力Figure 4 The Hydroxyl free racial－scavenging capacity of Extract，BHT ＆ VCin different concentrations

3 結論

本研究優化了油茶葉黃酮的超聲提取工藝，其最優工藝條件為：以50%乙醇溶液為提取劑，料液比1︰20（m︰V），提取溫度70℃，超聲功率300W，提取2次，每次30min，該條件下總黃酮得率為47.01mg RE/g。說明試驗采用正交分析法優化油茶葉中總黃酮的提取具有實際可行性，可為油茶葉的綜合開發利用提供參考依據。該結果比肖新生等［11］（4.17%）和黃陳陳［6］（46.82mg RE/g）的高，原因可能與采收期、粉碎粒徑等有關，還需進一步的研究。本試驗中采用的微波功率為300W，乙醇濃度為50%，與肖新生等［11］的（450W和60%乙醇）相比，節省了能量和有機溶劑，與黃陳陳［6］的（75%乙醇）節省了有機溶劑。

體外抗氧化試驗表明，油茶葉黃酮有很強的DPPH·、ABTS＋及·OH 清除活性，IC50分別為15.12，21.15，410.00μg RE/mL。對于其活性的深入研究可以考慮進行動物試驗。

隨著油茶葉研究的不斷深入，多種萃取方法聯用，其提取率將大大提高，且節能環保。油茶葉黃酮提取物可以作為新型的天然食品防腐劑加以開發利用，不僅可以減少對環境的污染，還可以提高油茶業的收入。

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