正交試驗優化水煎提取苜蓿棗芪總黃酮工藝

鄧發星 祝芙蓉 李坤江 付美華 田晨欣(西北民族大學化工學院， 甘肅 蘭州 7000)

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種高產優質的多年生豆科牧草,在世界許多國家廣泛栽培,也是我國推廣應用的主要牧草[1]。紫苜蓿含有大豆黃酮、皂苷、苜蓿酚、苜蓿素、瓜氨酸、糖等。紫花苜蓿具有品質好、產草量高、適口性好、營養豐富、易于家畜消化等特點,故有“牧草之王”美譽[2]。大棗(zizyphus jujuba dates)含有三帖酸、黃酮、環磷酸腺苷等。大棗既是普通食品，也是常用的藥品，久食或入藥膳，有補氣血，益脾胃，通九竅，潤膚養顏，延年養生之保健功效[3]。黃芪(Radix Astragali)是百姓經常食用的純天然品，現代醫學研究表明，黃芪有增強機體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應激、降壓和較廣泛的抗菌作用，能增強心肌收縮力，調節血糖含量，提高免疫功能，能夠延緩細胞衰老的進程。

探究苜蓿、大棗、黃芪三種藥食兩用材料中的活性物質含量對制備保健食品有一定幫助，有望改善亞健康、提高身體免疫力。總黃酮在三種材料中是具有代表性的活性物質，所以探究苜蓿棗芪中總黃酮提取工藝是有意義的。

1 材料與儀器

1.1 材料

中性濾紙(型號102中速，杭州特種紙業有限公司)，95%乙醇(分析純)，聚酰胺100目(層析柱用)，殼聚糖(醫藥級)，飲用水，苜蓿(采于西北民族大學化工學院)，黃芪(蘭州復興厚藥材有限責任公司第一藥莊)，大棗(蘭州隆興商貿有限公司)。

1.2 儀器

控溫水浴鍋(南通滬南科學儀器有限公司)，DHG—9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海—恒科學儀器有限公司)，干燥器，層析柱(泓宇儀器)，電子分析天平。

2 實驗步驟與結果

2.1 實驗前處理

稱取苜蓿約7g，黃芪約9g，大棗約6g，精密稱定。苜蓿截段，黃芪截段，大棗在150℃,45min進行干燥，大棗截段。

2.1.1 溶脹系數的測定

將三者混合物置于500ml圓底燒瓶中，量取200ml飲用水于圓底燒瓶中，冷浸24h,過濾，得濾液112.8ml，算得混合物共吸水87.2ml，即其溶脹系數為0.436。

2.1.2 水煎

將三者混合物置于500ml圓底燒瓶中，吸取適量飲用水置于圓底燒瓶中，冷浸45min，備用。

取備用物在一定條件下水煎。水煎后，冷卻至室溫，補齊其損失水分，將其過濾，備用。

2.1.3 聚酰胺實驗中乙醇洗脫總黃酮用量選擇

取備用原料在80℃、60min及料液比為1:6條件下水煎。分別設置三組實驗，各加入40ml、45ml、50ml乙醇洗脫黃酮，經干燥失重法測得黃酮量依次為10mg、10.3mg、10.02mg。三者平均值為10.17mg,經計算RSD=1.5%,小于2%。即選取乙醇用量為40ml。

2.1.4 聚酰胺吸附實驗

用量筒量取30ml濾液,加入約75mg殼聚糖，殼聚糖用于中藥水提液的澄清主要與其吸附性能和絮凝作用有關[4]，微微加熱使濾液中蛋白質充分沉淀，冷卻至室溫，補齊其損失水分，過濾，稱量約0.3g聚酰胺上柱，量取適量乙醇過柱洗脫聚酰胺中醇溶性雜質，用量筒量取沉淀蛋白后的溶液10ml裝柱，進行聚酰胺吸附黃酮實驗，聚酰胺具有吸附黃酮的特性[5]，量取95%乙醇40ml洗脫總黃酮。

理論 · 實踐2.1.5 干燥失重法測定總黃酮量及固化物量

使坩堝在105℃干燥至恒重，得重量m1。將洗脫的總黃酮置于坩堝中，用水蒸汽加熱至乙醇完全揮發，坩堝放入烘箱105℃干燥，30min后取出置干燥器中放冷，然后稱定重量，至恒重，得重量m2，即總黃酮量計算式為m2-m1。

固化物量測定依照黃酮量測定進行。

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 溫度的選擇

圖1 溫度對總黃酮提取量的影響

取備用混合物在60min、料液比為1∶7及溫度分別為70℃、80℃、90℃條件下水煎。通過聚酰胺吸附實驗得到70℃條件下黃酮量為72.65mg,80℃條件下黃酮量為133.47mg,90℃條件下黃酮量為115.53mg,如圖1所示。由圖1可得：總黃酮提取的最佳溫度為80℃。

2.2.2 料液比的選擇

取備用混合物在60min、80℃及料液比分別為1∶6、1∶7、1∶8條件下水煎。通過聚酰胺吸附實驗得到1∶6條件下黃酮量為98.34mg,1∶7條件下黃酮量為133.47mg,1∶8條件下黃酮量為130.11mg,如圖2所示。

圖2 料液比對黃酮提取量的影響

由圖2可得：總黃酮提取的最佳料液比為1∶7。

2.2.3 浸提時間和次數的選擇

取備用混合物在料液比為1∶7、80℃及浸提時間分別為30min、60min、90min、120min條件下水煎。通過聚酰胺吸附實驗得到30min條件下一煎黃酮量為86.45mg,二煎黃酮量為35.36mg；60min條件下一煎黃酮量為133.47mg,二煎黃酮量為91.25mg；90min條件下一煎黃酮量為129.32mg,二煎黃酮量為85.31mg；120min條件下一煎黃酮量為124.37mg,二煎黃酮量為82.57mg；如圖3所示。

圖3 浸提時間和次數對黃酮提取量的影響

由圖3可得：總黃酮最佳的浸提時間為60min，由于二煎提取的總黃酮量趨勢變化較一煎明顯，即最佳浸提次數為2次。

2.3 正交試驗因素水平設計及數據處理

通過單因素試驗的分析，選取各因素中最佳條件附近試驗點作為正交試驗點，對各個試驗結果進行誤差分析，確定最佳提取黃酮工藝方案。本試驗采用L9(34)正交表，以溫度(A)、浸提時間(B)、料液比(C)作為三個因素，每個因素設計三個水平進行試驗。

表1 水煎法提取黃酮正交試驗因素與水平

針對表1所設計的正交試驗因素與水平進行一煎提取試驗，總黃酮提取結果見表2，總黃酮提取結果方差分析見表3，固化物結果見表4，固化物方差分析見表5。

表2 總黃酮提取結果

由表2極差結果分析得到，RC>RA>RB。三個因素對苜蓿棗芪中總黃酮提取的影響程度為：料液比(C)>溫度(A)>浸提時間(B)。

表3 總黃酮提取結果方差分析

表3分析得到，試驗所測得的F值均大于F0.05(2,2)=19.00，所以料液比、溫度及浸提時間均具有顯著性，在正交試驗范圍內，優化水煎苜蓿棗芪中總黃酮提取工藝為A3B3C3，即料液比為1∶7.5，溫度85℃，浸提時間為75min。

通過對固化物結果極差分析得到，RC>RA>RB。三個因素對苜蓿棗芪中總黃酮提取的影響程度為：料液比(C)>溫度(A)>浸提時間(B)。同時從固化物結果方差分析中得到，料液比(C)及溫度(A)均具有顯著性，與表3分析結果一致，證實總黃酮提取最佳工藝為A3B3C3是合理的。

表4 固化物結果

表5 固化物結果方差分析

2.4 正交最佳試驗驗證

在總黃酮提取最佳工藝為A3B3C3條件下進行3組平行驗證實驗，結果如表6所示。

表6 A3B3C3條件下一煎結果

由表6得：苜蓿大棗黃芪三種原料平均量為22.02mg，一煎總黃酮平均量為197.12mg及其收率為0.90%，一煎固化物量為3881.32mg及其收率為17.63%。

2.5 結果

實驗選定水煎浸提次數為2次，由正交驗證實驗中各數據進行二煎后結果如表7所示。

表7 A3B3C3條件下二煎結果

結合A3B3C3條件下在煎煮2次后，所得到3組苜蓿棗黃芪平均量為22.02g，總黃酮平均量為283.10mg及其收率為1.29%；固化物平均量為6521.45mg及其收率為29.62%。

3 結語

(1)本實驗采用正交試驗法選取苜蓿棗芪中總黃酮最佳提取工藝條件：溫度為85℃、料液比為1∶7.5、浸提時間為75min、浸提次數為2次，得到總黃酮收率為1.29%，固化物收率為29.62%。

(2)水煎法是中藥傳統提取方法，結合單因素試驗法和正交試驗法探究影響總黃酮提取的因素，采用聚酰胺吸附法和重量法測定總黃酮量。方法簡單易行。

(3)試驗中采用殼聚糖作為絮凝劑，除去提取液中的蛋白質及鞣質等雜質。殼聚糖以其成本低，具有良好的生物學可溶性，又能保留有效成分等特點，被廣泛應用于中藥藥液的精制[6]。

(4)重量法要求對實驗者有較高操作能力，由此也會造成一定誤差。

[1,2]朱見明，李娜，張亞軍,等.苜蓿黃酮的研究進展[J].草業科學，2009,26(9)：156.

[3]王蓉珍，趙子青，林勤保,等.大棗功效成分檢測的研究進展[J].食品工業科技，2012,33(4)：423.

[4]張彤，徐連英，蔡貞貞.殼聚糖澄清劑精制中藥水提液的應用前景[J].中國中藥雜志，2001,26(8)：517.

[5]張中建，閻小偉.聚酰胺吸附法測定總黃酮[J].分析檢測，2002,23(10)：81.

[6]孫星，盛華剛，張超，等.殼聚糖絮凝沉降法對葛根芩連湯中黃酮和生物堿成分的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2012,18(20)：15.