TNF-α和HSP70-2基因多態性與急性胰腺炎的相關性研究

胡家平，莊建新，李勇，余永歡，胡慶紅，賴銀英，吳安濤

TNF-α和HSP70-2基因多態性與急性胰腺炎的相關性研究

胡家平，莊建新△，李勇，余永歡，胡慶紅，賴銀英，吳安濤

目的探討腫瘤壞死因子（TNF）-α和熱休克蛋白（HSP）70-2基因多態性與急性胰腺炎（AP）的相關性。方法運用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RLFP）檢測72例AP患者(AP組)和71例正常人（對照組）的TNF-α及HSP70-2基因多態性。結果AP組與對照組的TNF-α基因型和等位基因比例間差異無統計學意義；AP組中，重型胰腺炎（SAP）和輕型胰腺炎（MAP）的TNF-α基因型和等位基因間差異無統計學意義。TNF-α和HSP70-2基因AA型與GA+GG型患者的白細胞、C反應蛋白（CRP）、淀粉酶、三酰甘油、血糖差異均無統計學意義；AP組的HSP70-2基因GA+GG型患者比例高于對照組（69.4%vs 49.3%），AP組攜帶的G等位基因比例高于對照組（46.5%vs 31.7%）,差異均有統計學意義。AP組中，SAP的GA+GG型比例高于MAP（81.0%vs 53.3%），差異有統計學意義；而G等位基因在SAP和MAP間無明顯差異（P＞0.05）。結論TNF-α基因多態性與AP不相關，HSP70-2基因多態性與AP相關，攜帶G等位基因發生重癥AP的可能性增大，可能是重癥AP的易感因素之一。

腫瘤壞死因子α；HSP70熱休克蛋白質類；胰腺炎；基因多態性；HSP70-2；多態性，限制性片斷長度；聚合酶鏈反應

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是指多種病因引起的胰酶激活，繼以胰腺局部炎癥反應為主要特征，伴或不伴有其他器官功能改變的疾病。臨床上，大多數AP患者的病程呈自限性，20%～30%的患者臨床過程兇險，病死率可達5%～10%[1]。目前其發病機制尚未完全闡明，研究發現在AP早期，胰腺星狀細胞中的促炎因子表達上調[2]。遺傳因子特別是AP相關的炎癥因子，可能是胰腺損傷甚至是AP嚴重程度和炎癥進展中一個重要的易感因素。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)數量巨大，分布廣，目前被認為是最有價值的遺傳標記[3]。有研究報道腫瘤壞死因子（TNF）-α和熱休克蛋白（HSP）70-2基因多態性與多種炎癥性疾病有關[4-5]，但關于TNF-α和HSP70-2基因多態性與AP易感性的相關研究較少，本研究檢測TNF-α及HSP70-2的基因多態性，并探討其與AP的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2012年6月—2013年2月在我院就診的發病72 h內的AP患者72例作為AP組，年齡（54.9± 14.1）歲。診斷標準符合中華醫學會消化病學分會胰腺疾病學組制定標準[1]及中華醫學會外科學會胰腺外科學組制定標準[6]。其中輕型胰腺炎（MAP）30例，重型胰腺炎（SAP）42例。選擇同期我院查體健康人71例為對照組，年齡（50.6± 13.9）歲。

1.2 TNF-α及HSP70-2基因多態性檢測

1.2.1 引物擴增采研究對象外周血3 mL于EDTA抗凝管。采用經典苯酚-氯仿提取法從全血中提取基因組DNA，溶解于50 μLTE液中，-20℃冰箱保存。參考文獻[7]及GenBank設計引物，由Invitrogen公司合成。TNF-α引物:上游5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3′，下游5′-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3′，擴展片段長度107 bp；HSP70-2引物:上游5′-CAGCAAAGTCCTTGAGTCCC-3′，下游5′-TCCGAAGGACTGGAGCTCTTG-3′，擴展片段長度2 075 bp。TNF-α和HSP70-2 PCR反應體系均為50 μL：取DNA模板1 μL，分別加入TNF-α和HSP70-2引物，然后加入TaqDNA合成酶。擴增條件：（1）TNF-α。95℃預變性5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃45 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min；（2）HSP70-2。94℃預變性5 min；95℃1 min，60℃1 min，72℃3 min，共35個循環，最后72℃延伸10 min。

1.2.2 酶切反應取10 μLTNF-αPCR產物加入NcoⅠ限制性內切酶，10 μL HSP70-2 PCR產物加入PstⅠ限制性內切酶，均在37℃恒溫水浴鍋過夜。于2%瓊脂糖凝膠電泳下分析TNF-α酶切產物，1%瓊脂糖凝膠電泳下分析HSP70-2酶切產物，與標準DNA Marker比對。

1.3 統計學方法應用SPSS17.0軟件包進行統計分析，基因型及等位基因頻率采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料用或M（P25，P75）表示，組間比較采用t檢驗或非參Z檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α、HSP70-2基因PCR產物酶切結果TNF-α基因PCR產物經NcoⅠ酶切后凝膠電泳結果顯示GG型（87 bp+20 bp，由于20 bp太小無法顯示，但不影響結果判定）、GA型（107 bp+87 bp+20 bp，圖中未見此型）和AA型（107 bp）；HSP70-2基因PCR產物經PstⅠ酶切后凝膠電泳結果顯示GG型（1 139 bp+936 bp）、GA型（2 075 bp+1 139 bp+ 936 bp）和AA型（2 075 bp），見圖1、2。

Fig.1TNF-α polymorphism in the result of 2%sepharose electrophoresis圖1 TNF-α基因多態性2%瓊脂糖凝膠電泳結果

Fig.2HSP70-2 polymorphism in the result of the 1%sepharose electrophoresis圖2 HSP70-2基因多態性1%瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2 TNF-α基因多態性與AP易感性的關系AP組與對照組的TNF-α基因型和等位基因比例間差異無統計學意義，見表1；AP組中，SAP組和MAP組的TNF-α基因型和等位基因間差異無統計學意義，見表2。

Tab.1Comparison of TNF-α genotype and allele between AP group and control group表1 AP組和對照組TNF-α基因型和等位基因比較例（%）

Tab.2Comparison of TNF-α genotype and allele between SAP and MAP groups表2 SAP組和MAP組的TNF-α基因型和等位基因比較例（%）

2.3 不同TNF-α基因型患者的有關臨床檢驗參數比較TNF-α基因AA型與GA+GG型患者的白細胞、CRP、淀粉酶、三酰甘油、血糖差異均無統計學意義，見表3。

Tab.3Comparison of clinical laboratory parameters between AP patients with different TNF-α genotypes表3 不同TNF-α基因型AP患者的臨床檢驗參數比較

2.4 HSP70-2基因多態性與AP易感性的關系AP組的HSP70-2基因GA+GG型患者比例高于對照組，AP組攜帶的G等位基因比例高于對照組（均P＜0.05），見表4。AP組中，SAP組的GA+ GG型比例高于MAP組；而G等位基因在SAP組和MAP組間無明顯差異（P＞0.05），見表5。

Tab.4Comparison of HSP70-2 genotype and allele between AP group and control group表4 AP組和對照組HSP70-2基因型和等位基因比較例（%）

2.5 不同HSP70-2基因型患者的有關臨床檢驗參數比較HSP70-2基因AA型與GA+GG型患者的白細胞、血糖、CRP、淀粉酶、三酰甘油差異均無統計學意義，見表6。

Tab.5Comparison of HSP70-2 genotype and allele between SAP and MAP groups表5 SAP組和MAP組HSP70-2基因型和等位基因比較例（%）

Tab.6Comparison of clinical laboratory parameters between AP patients with different HSP70-2 genotypes表6 不同HSP70-2基因型AP患者的臨床檢驗參數比較

3 討論

AP是常見的消化系統疾病之一，是因早期炎癥使胰腺腺泡中的胰酶過早激活導致自身組織消化的過程[8]，其病理過程包括水腫、出血和壞死。TNF-α在AP的血清中是可以被檢測出來的。在炎癥反應早期，TNF-α可以激活中性粒細胞，促進多種炎癥介質釋放，在AP的發生發展過程中起重要作用[9]。本研究結果顯示：AP組與對照組的TNF-α基因型和等位基因無明顯差異；輕癥和重癥AP間也無明顯差異，雖然GG型比例在AP中所占比例較高（72.2%，52/72）；且不同基因型的血液檢測指標亦無明顯差異，提示TNF-α基因的多態性可能與AP發病、嚴重程度及血液指標無關。與?zhan等[10]、Yang等[11]的研究結論基本一致。但也有不一致的研究，Balog等[7]研究發現TNF-α的308A位點基因多態性是SAP的影響因素，其認為基因型檢測可以預測輕重癥AP的過程和預后。Dianliang等[12]研究表明TNF-α-308位點多態性與AP不相關，但與AP的膿毒血癥相關。以上研究結果的不同可能與不同種族、地域及樣本量差異有關，尚需開展多中心、大樣本的試驗進行研究。

HSP70-2蛋白作為轉換蛋白的分子伴侶，參與受損蛋白質的修復，使其恢復活性，從而在蛋白水平起到預防、保護的作用[13]，在受到炎癥、受熱、缺血、缺氧或代謝性毒物等因素刺激時，細胞內迅速表達HSP70-2[14]。本研究結果顯示：AP組GA+GG型比例高于對照組；AP組攜帶G等位基因的比例高于對照組。AP組中SAP的GA+GG型比例高于MAP；而G等位基因在SAP和MAP間無明顯差異。Balog等[7]研究發現，重癥AP患者攜帶HSP-70-2等位基因G的比例高于輕癥AP患者和健康人群，而具有AA型基因的AP，很少發展為重癥胰腺炎，HSP70-2等位基因G是急性重癥胰腺炎的危險因素，與本研究結果一致。

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（2014-07-15收稿2014-09-02修回）

（本文編輯閆娟）

Polymorphisms of TNF-α gene and HSP70-2 gene in patients with acute pancreatitis

HU Jiaping,ZHUANG Jianxin△,LI Yong,YU Yonghuan,HU Qinghong,LAI Yinying,WU Antao
The First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China△

ObjectiveTo investigate the association of tumor necrosis factor(TNF)-α,heat shock protein(HSP)70-2 gene polymorphisms and susceptibility of acute pancreatitis(AP).MethodsUsing case-control method，The gene polymorphism of TNF-α and HSP70-2 was detected by PCR-RLFP in 72 patients with AP and 71 healthy controls.Results There were no significant differences in proportion of TNF-α genotype and alleles between AP and control groups(P＞0.05). There were no significant differences in TNF-α genotype and alleles between severe acute pancreatitis(SAP)and light acute pancreatitis(MAP)of AP group(P＞0.05).There were no significant differences in white blood cell count,C-reactive protein(CRP),amylase,three acyl glycerin and glucose between TNF-a and HSP70-2 gene of AA type and GA+GG type patients(P＞0.05).The HSP70-2 genotype GA+GG proportion was significantly higher in AP group than that of control group（69.4%vs 49.3%).The ratio of patients with G allele was significantly higher in AP group than that of control group（46.5% vs 31.7%).The ratio of patients with GA+GG type AP was significantly higher in SAP patients than that of MAP patients of AP group（81.0%vs 53.3%).There was no significant difference in G allele between SAP and MAP patients(P＞0.05). ConclusionTNF-α polymorphisms is not associated with acute pancreatitis.There is an association between HSP70-2 polymorphisms and acute pancreatitis.Carrying the G allele increases the possibility of a severe acute pancreatitis，which is one of the genetic susceptibility factors of severe acute pancreatitis.

tumor necrosis factor-alpha；HSP70 heat-shock proteins；pancreatitis；genetic polymorphism；HSP70-2；polymorphism,restriction fragment length;polymerase chain reaction

R576

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.015

江西省科技廳支撐計劃

南昌大學第一附屬醫院普外科五病區（郵編330006）

胡家平（1967），男，副主任醫師，副教授，碩士生導師，碩士，主要從事胃腸腫瘤研究

△通訊作者E-mail：zjx136@qq.com