1,25(OH)2D3對人腎小球系膜細胞增殖及PCNA表達的影響

尹璇,張昊,陳建平,馬莉,張春江,楊曉萍△

1,25(OH)2D3對人腎小球系膜細胞增殖及PCNA表達的影響

尹璇1,張昊1,陳建平1,馬莉1,張春江2,楊曉萍2△

目的探討1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]對人腎小球系膜細胞中增殖細胞核抗原（PCNA）表達及細胞增殖的影響。方法體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞，取傳代培養(yǎng)至3～8代細胞隨機分為4組：正常對照組（加含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基），增殖對照組（EGF組，加10 μg/L的EGF），一般干預(yù)組[VD組，加10-8mol/L 1,25(OH)2D3]，增殖干預(yù)組[EGF+VD組，加10 μg/L EGF及10-8mol/L1,25(OH)2D3]，均作用48 h。流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期；Western blot檢測各組PCNA表達的情況。結(jié)果（1）細胞周期。與正常對照組相比，EGF組G1期細胞明顯減少，S、G2/M期細胞增多，增殖指數(shù)（PI）較高；VD組G1期細胞明顯增多，S、G2/M期細胞減少，PI較低；與EGF組相比，VD組和EGF+VD組G1期細胞增多，S、G2/M期細胞減少，PI較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）系膜細胞中PCNA蛋白的表達。與正常對照組相比，EGF組PCNA的表達較高，VD組PCNA的表達較低；與EGF組相比，VD組和EGF+VD組PCNA的表達較低。結(jié)論1,25(OH)2D3通過阻滯細胞周期、抑制PCNA的表達，從而抑制人腎小球系膜細胞的增殖。

腎小球系膜細胞；增殖細胞核抗原；表皮生長因子；細胞增殖；細胞周期；1,25-二羥基維生素D3

腎小球硬化是慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）最常見的病理表現(xiàn)，其特征是腎小球系膜細胞（mesangial cells，MC）過度增殖和細胞外基質(zhì)（ECM）的積聚。研究與腎小球系膜細胞增殖有關(guān)的因素，對腎小球損傷的逆轉(zhuǎn)非常重要[1]。增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一種在細胞周期的G1晚期和S期合成的蛋白質(zhì)，在DNA合成與修復(fù)和細胞周期調(diào)控中被作為常用的增殖標志物，檢測PCNA是研究細胞的增殖活性的既定方法[2]。腎小球系膜細胞增生的程度可以由免疫染色PCNA或巨噬細胞抗原（ED-1）進行評估[3]。1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]是維生素D3的生物活性形式，具有多種新型生物學(xué)效應(yīng)，包括促使腫瘤細胞生長停滯，誘導(dǎo)細胞凋亡和分化。已有研究表明1,25(OH)2D3可顯著抑制大鼠腎小球系膜細胞增殖[4]。本研究探討1,25(OH)2D3對人腎小球系膜細胞增殖及PCNA表達的影響，為1,25(OH)2D3的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料（1）細胞株。人腎小球系膜細胞株(4200)購于湘雅醫(yī)學(xué)院中心實驗室。（2）試劑。低糖DMEM、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；青鏈霉素混合液、二甲基亞砜（DMEO，北京索萊寶生物科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液即PBS、1,25(OH)2D3、表皮生長因子（EGF）、碘化丙啶(美國Sigma公司)；小鼠抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人PCNA單克隆抗體（Cell Signaling公司）；山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基復(fù)蘇腎小球系膜細胞，取傳代培養(yǎng)至3～8代細胞用于實驗，采用完全隨機法將其分為4組：正常對照組（加含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基），增殖對照組（EGF組，加10 μg/L的EGF），一般干預(yù)組[VD組，加10-8mol/L的1,25(OH)2D3]，增殖干預(yù)組[EGF+VD組，加10 μg/L EGF以及10-8mol/L 1,25(OH)2D3]，均作用48 h。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞周期取對數(shù)期細胞，以2×105個/mL、2 mL/孔接種于6孔板內(nèi)，按實驗分組培養(yǎng)48 h，用胰蛋白酶消化細胞并收集，加入75%冰乙醇，吹打均勻，-20℃固定過夜，上機前再次離心，并用PBS洗滌1遍后，加500 μL PBS重懸細胞，加入RNA酶使其終濃度為10 g/L，30 min后加PI染色，終濃度變?yōu)?0 mg/L，37℃避光保存，30 min后流式細胞儀檢測細胞周期，計算增殖指數(shù)[PI=（S+G2M）/（G1+ S+G2M）]。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測人腎小球系膜細胞中PCNA的表達取對數(shù)期細胞，胰蛋白酶消化計數(shù)后，接種于一次性培養(yǎng)瓶，24 h后細胞貼壁，用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，同步化于G0期，按實驗分組培養(yǎng)48 h，收集并裂解細胞，高速低溫離心25 min，取上清煮沸5～10 min使蛋白變性，上樣電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%奶粉封閉，將PVDF膜置于一抗孵育（4℃過夜），TBST洗滌3×10 min，二抗孵育（室溫1 h），TBST洗滌3×10 min，加ECL發(fā)光試劑，暗室曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腎小球系膜細胞形態(tài)及生長情況的比較正常對照組胞體透亮，形態(tài)呈梭形，不規(guī)則星形、樹枝狀，密集處細胞重疊呈網(wǎng)狀，胞漿、胞質(zhì)較清楚；EGF組數(shù)目較多，形態(tài)與正常對照組相比無明顯改變；VD組呈現(xiàn)一定程度的細胞凋亡，細胞體積縮小，胞核皺縮，數(shù)目較正常對照組減少，部分細胞漂浮；EGF+VD組細胞形態(tài)及生長情況與正常對照組大致相同，數(shù)目略有增加，見圖1。

Fig.1Changes of mesangial cell morphology after 48-h drug intervention圖1 藥物干預(yù)48 h后系膜細胞形態(tài)的變化(×200)

2.2 1,25(OH)2D3對腎小球系膜細胞周期的影響與正常對照組相比，EGF組G1期細胞明顯減少，S、G2/M期細胞增多，PI較高；VD組G1期細胞明顯增多，S、G2/M期細胞減少，PI較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；EGF+VD組細胞周期各時相分布與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與EGF組相比，VD組和EGF+VD組G1期細胞增多，S、G2/M期細胞減少，PI較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

2.3 腎小球系膜細胞中PCNA的表達情況正常對照組、EGF組、VD組和EGF+VD組PCNA/β-actin灰度值比值分別是1.09±0.15、1.62±0.20、0.69±0.14和1.14±0.24，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.720，P＜0.05）。與正常對照組相比，EGF組PCNA的表達較高，VD組PCNA的表達較低，EGF+VD組與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與EGF組相比，VD組和EGF+VD組PCNA的表達較低。與正常對照組比較，EGF組可見蛋白條帶明顯粗而深，VD組蛋白條帶則變淺變細，EGF+VD組與正常對照組接近,見圖2。

Tab.1The distribution of cell cycle detected by flow cytometry in four groups表1 4組細胞周期各時相分布比較（n=10，%，)

Tab.1The distribution of cell cycle detected by flow cytometry in four groups表1 4組細胞周期各時相分布比較（n=10，%，)

＊P＜0.05；a與正常對照組比較，b與EGF組比較，P＜0.05

組別正常對照組EGF組VD組EGF+VD組F細胞周期各時相分布G1期S期G2/M期74.38±1.63 64.71±1.70a80.89±1.47ab73.88±1.37b184.350＊19.75±1.27 26.73±1.48a14.54±1.11ab20.58±1.72b124.391＊5.08±1.87 7.44±2.26a4.42±2.00ab6.08±1.89b4.283＊PI 25.02±1.11 34.52±1.97a18.98±1.58ab26.48±2.12b135.424＊

Fig.2PCNA expression of mesangial cells detected by Western-blot assay in four groups圖2 Western-blot檢測各組系膜細胞中PCNA表達的情況

3 討論

1,25(OH)2D3是維生素D3的生物活性形式，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。除了經(jīng)典的鈣、磷調(diào)節(jié)作用外，1,25(OH)2D3可通過誘導(dǎo)細胞凋亡及阻滯細胞周期，導(dǎo)致細胞凋亡及生長停滯[5]。研究發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3干預(yù)后，腎功能衰竭（腎衰）大鼠模型中系膜細胞減少，PCNA染色表達量也降低，提示PCNA可用來檢測腎小球系膜細胞的增殖情況[6]。另有研究表明1, 25(OH)2D3在治療大鼠腎炎模型的過程中可減少蛋白尿，炎性細胞浸潤，抑制腎小球系膜細胞增殖，加速腎小球損傷修復(fù)等重要作用[7]。

PCNA作為反映細胞增殖最主要的標志物之一，PCNA mRNA的表達存在于細胞周期的所有階段，在多種細胞中發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)控細胞周期和DNA復(fù)制的功能[8-9]。本課題組前期研究1,25(OH)2D3對大鼠系膜增生性腎炎的作用發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3可從多方面抑制PCNA的表達，并抑制腎小球系膜細胞增殖，從而延緩腎小球疾病的進展[10]。本研究進一步探討1,25(OH)2D3對人腎小球系膜細胞中PCNA表達的影響，結(jié)果顯示，1,25(OH)2D3干預(yù)腎小球系膜細胞后，與正常對照組比較，光鏡下細胞數(shù)目明顯減少，呈現(xiàn)一定程度的細胞凋亡，細胞體積縮小，胞核皺縮；G1期細胞顯著增多，S期、G2/M期細胞數(shù)量明顯減少，提示1,25(OH)2D3可通過阻滯細胞周期，使細胞停滯在G1靜止期，不轉(zhuǎn)入S期、G2期進行DNA復(fù)制、有絲分裂，從而抑制細胞增殖；本研究中VD組PCNA表達量較正常對照組顯著降低，進一步證實1,25(OH)2D3通過抑制人腎小球系膜細胞中PCNA的表達來抑制細胞增殖。

EGF是一種小肽，由53個氨基酸殘基組成，是在體內(nèi)體外都對多種組織細胞有強烈的促分裂作用的一種多功能生長因子。EGF可減少細胞凋亡，并促進細胞增殖[11]。研究表明醛固酮通過激活依賴EGF結(jié)合EGFR的PI3K/Akt信號通路刺激腎小球系膜細胞增殖[12]。因此本研究設(shè)立EGF誘導(dǎo)腎小球系膜細胞增殖的微環(huán)境，進一步觀察1,25(OH)2D3是否在細胞被誘導(dǎo)增殖的情況下，同樣可以抑制細胞周期。結(jié)果顯示，1,25(OH)2D3聯(lián)合EGF干預(yù)后與EGF組比較，G1期細胞顯著增多，S期、G2/M期細胞數(shù)目明顯減少，提示1,25(OH)2D3可通過抑制細胞周期來抑制正常腎小球系膜細胞增殖，也可抑制EGF作用下的腎小球系膜細胞增殖；研究還發(fā)現(xiàn)1,25 (OH)2D3聯(lián)合EGF干預(yù)后與EGF組比較，腎小球系膜細胞中的PCNA表達量也明顯下降，提示1,25 (OH)2D3可通過抑制EGF作用下細胞PCNA的表達來抑制細胞增殖。

綜上所述，1,25(OH)2D3可通過阻滯細胞周期和抑制PCNA的表達來抑制人腎小球系膜細胞的增殖，并可抑制EGF對人腎小球系膜細胞的增殖作用，但其具體作用機制有待進一步研究證實。

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（2014-09-03收稿2014-09-28修回）

（本文編輯陳麗潔）

Effects of 1,25(OH)2D3on proliferation and expression of PCNA of human glomerular mesangial cells

YIN Xuan1,ZHANG Hao1,CHEN Jianping1,MA Li1,ZHANG Chunjiang2,YANG Xiaoping2△
1 Medical College of Shihezi University,Xinjiang 832000,China;2 Department of Nephrology,the First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University△

ObjectiveTo investigate the effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3[1,25(OH)2D3]on PCNA expression and cell proliferation in human glomerular mesangial cells.MethodsThe cultured human mesangial cells,which was subcultured 3-8 generations,were randomly divided into four groups:normal control group(plus the DMEM medium containing 5%fetal bovine serum),proliferation in the control group(EGF group,plus 10 μg/L of EGF),general intervention group[VD group,plus 10-8mol/L of 1,25(OH)2D3],proliferation in the intervention group[EGF+VD group,plus 10 μg/L EGF and 10-8mol/L 1,25(OH)2D3]for treatment of 48 h.The cell cycle was detected by flow cytometry，and the expression of PCNA was detected by Western blot assay in four groups.Results(1)Compared with normal control group,G1phase cells were significantly reduced,S,G2/M phase cells were increased and PI index was higher in EGF group.And G1phase cells were significantly increased,S and G2/M phase cells were significantly decreased,and PI index was lower in VD group.Compared with the EGF group,G1phase cells were significantly increased in VD group and EGF+VD group,and S,G2/M phase cells decreased,PI index was lower.(2)Compared with normal control group,the expression of PCNA was higher in EGF group,and lower in VD group.Compared with EGF group,the expression of PCNA was lower in VD group and EGF+VD group.Conclusion1,25(OH)2D3inhibits the proliferation of human glomerular mesangial cells by arresting cell cycle and inhibiting the expression of PCNA protein.

glornerular mesangial cells;proliferating cell nuclear antigen;epidermal growth factor;cell proliferation; cell cycle;1,25(OH)2D3

R692

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.005

國家自然科學(xué)基金資助項目（81160090）

1新疆石河子大學(xué)（郵編832000）；2新疆石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科

尹璇（1988），女，碩士在讀，主要從事腎小管疾病研究

△通訊作者E-mail:sbkyxp@163.com