活血化瘀法對急性心肌梗死大鼠CD34、血管內皮生長因子陽性細胞的影響

師偉，李曄紫，趙海濱，楊丹丹，姜天元，李東方，翟瑤瑤

·基礎研究·

活血化瘀法對急性心肌梗死大鼠CD34、血管內皮生長因子陽性細胞的影響

師偉1，李曄紫2，趙海濱2，楊丹丹2，姜天元2，李東方2，翟瑤瑤2

目的 研究活血化瘀法對大鼠心肌組織微環境中CD34、血管內皮生長因子(VEGF)的影響，探討其治療急性心肌梗死的機制。方法 Sprague-Daw ley大鼠32只隨機分為假手術組(n=8)、模型組(n=8)、中藥+粒細胞集落刺激因子(G-CSF)組(n=8)和G-CSF組(n=8)。各組均于造模3 h后給予相應藥物，連續6 d，第7天處死取材。蘇木素-伊紅(HE)染色觀察病理形態，免疫組化染色檢測梗死心肌邊緣區CD34、VEGF、Ki-67陽性細胞表達。結果 模型組、中藥+G-CSF組和G-CSF組CD34、VEGF、Ki-67陽性細胞表達均高于假手術組(P＜0.05)；中藥+G-CSF組、G-CSF組高于模型組(P＜0.05)；中藥+G-CSF組CD34、VEGF陽性表達高于G-CSF組(P＜0.05)，兩組Ki-67陽性細胞表達無顯著性差異(P＞0.05)。結論 活血化瘀法能夠提高CD34和VEGF的表達，其作用優于單獨使用G-CSF，可以有效治療急性心肌梗死。

急性心肌梗死；骨髓干細胞；血管內皮生長因子；微環境；活血化瘀法

[本文著錄格式] 師偉，李曄紫，趙海濱，等.活血化瘀法對急性心肌梗死大鼠CD34、血管內皮生長因子陽性細胞的影響[J].中國康復理論與實踐,2015,21(8):894-899.

CITED AS:ShiW,LiYZ,Zhao HB,etal.Effectof Activating Blood to Resolve Stagnation on cellsexpressing CD34and vascular endothelialgrow th factor in ratswith acutemyocardial infarction[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(8):894-899.

急性心肌梗死(acutemyocardial infarction,AM I)產生的局部無收縮功能的瘢痕組織是導致心肌重塑、心臟破裂以及心力衰竭等嚴重并發癥的重要因素。研究發現，AM I后動員骨髓干細胞(CD34陽性細胞)定向歸巢，并在梗死心肌局部微環境的誘導下，可以達到再生心肌和血管的目的，實現 “無創性”組織再生[1]。微環境對干細胞在心肌內存活、分化起決定性作用[2]。心肌梗死急性期心肌組織微環境突出表現為血管內皮生長因子(vascular endothelial grow th factor, VEGF)、腫瘤壞死因子α和大量炎性細胞浸潤等顯著增加以及氧化應激反應增加[3]。研究證實，AM I后VEGF分泌增加，能促進內皮細胞分裂增殖、趨化和遷移；還能動員CD34陽性細胞定向歸巢及轉化[4]。而CD34陽性細胞的旁分泌作用可使其在歸巢后分泌一定量的VEGF。在AM I后心肌梗死局部微環境中CD34陽性細胞與VEGF有一定的交互作用[5]。本次實驗以CD34、VEGF為靶點對微環境影響AM I的治療進行初步的探索。

在本課題組 “祛瘀血、生新血”為理論基礎的前期研究[6-7]下，把宏觀辨證與微觀辨證相結合，使用具有活血祛瘀、通脈活絡作用的血塞通注射液(主要成分為三七總皂苷)作為中藥干預，以目前國際上主要使用的粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)作為心肌梗死后干細胞歸巢的有效動員劑[8]，探討活血化瘀法治療AM I的效應靶點及療效，為活血化瘀藥治療AM I提供有效的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康清潔級雄性Sprague-Daw ley大鼠48只，體質量240～260 g，由北京中醫藥大學東直門動物實驗中心提供。將其隨機分為假手術組、模型組、中藥+ G-CSF組和G-CSF組。

1.2 實驗用藥物、試劑

G-CSF：哈藥集團生物工程有限公司；血塞通注射液：昆明制藥集團股份有限公司；VEGF小鼠源性單克隆抗體、Ki-67山羊源性多克隆抗體、CD34小鼠源性單克隆抗體、CD34兔源性單克隆抗體：圣克魯斯；DAB免疫組化顯色試劑盒、山羊SP試劑盒、小鼠SP試劑盒：中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

急性心肌梗死模型的建立[8-9]：大鼠適應性飼養觀察3 d，以3%水合氯醛10m l/kg腹腔麻醉，仰面固定于鼠板，經口氣管插管行小動物呼吸機輔助呼吸，有氧正壓通氣，呼吸頻率80次/m in，吸呼比1∶2，潮氣量5～6m l。經左前胸廓旁第3、4肋間逐層開胸，暴露心臟，分離心包，在肺動脈圓錐和左心耳交界處用5/ 0號絲線結扎左冠狀動脈前降支(leftanterior descending,LAD)近端制成心肌梗死模型，結扎后觀察心臟數分鐘，可見左心室前壁顏色變蒼白、收縮力減弱即認為造模成功，然后逐層縫合心腔。術后常規抗感染治療。

假手術組大鼠經歷上述手術過程，絲線從冠狀動脈下穿過但不結扎。

術后立即腹腔注射給藥，給藥量按《藥理實驗方法學》所示劑量換算法計算：大鼠劑量(g/kg)=成人的劑量[1 g/(kg·d)]×0.018。

G-CSF組每天注射G-CSF注射液5μl。中藥+ G-CSF組每天注射血塞通注射液2.5m l及G-CSF液5 μl。模型組及假手術組同上法注射等量的生理鹽水。每天1次，共用6 d。

1.4 病理形態學檢查

第7天各組處死大鼠，取心肌組織，切心臟最大橫徑，把下半部分進行包埋。用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規蘇木素-伊紅(HE)染色。在光鏡下進行病理觀察。

1.5 免疫組化染色

連續給藥6 d，第7天各組處死大鼠，取出心臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，常規脫蠟浸水，0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)中抗原修復23 m in；取出靜止30 m in，恢復至室溫，PBS沖洗2 m in，共3次。

滴加1∶50稀釋的CD34、VEGF一抗(PBS做陰性對照)，放入濕盒，4℃過夜，PBS沖洗2min，共3次；滴加生物素標記羊抗小鼠IgG工作液(二抗)，37℃孵育15m in，PBS沖洗5m in，共3次；滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液(二抗)，37℃孵育15min，PBS沖洗5m in，共3次。

3%H2O2室溫避光孵育15m in，以消除內源性過氧化物酶；PBS沖洗2m in，共3次；滴加1∶200稀釋的Ki-67一抗(PBS做陰性對照)，放入濕盒，4℃過夜，PBS沖洗2m in，共3次；滴加二抗工作液生物素標記小鼠抗羊IgG工作液(二抗)，37℃孵育15min, PBS沖洗5m in，共3次；滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液(二抗)，37℃孵育15m in，PBS沖洗5m in，共3次。

DAB顯色劑顯色5m in，流水沖洗3次；蘇木素復燃，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。400倍光鏡下取4個視野，攝片，圖像分析軟件計算積分光密度值(IOD)。

1.6 統計學分析

2 結果

32只大鼠造模成功，取8只作為假手術組，其余每組8只。

2.1 病理形態學觀察

模型組梗死區室壁變薄，心肌細胞數量減少，大量炎性細胞浸潤，結締組織整片廣布，成纖維細胞多，梗死邊緣區可見充血及炎性細胞帶。中藥+ G-CSF組大鼠心肌細胞排列紊亂，部分出現壞死，梗死邊緣區可見炎性細胞帶。G-CSF組心肌細胞排列紊亂，心肌細胞數量減少，可見炎性細胞侵潤。假手術組心肌細胞排列規則，細胞間偶見炎性細胞。見圖1。

2.2 CD34陽性細胞

心肌CD34陽性細胞存在于胞漿，以心肌梗死邊緣區多見。模型組可見梗死區細胞溶解，假手術組未見梗死區。模型組、中藥+G-CSF組、G-CSF組心肌梗死邊緣區CD34陽性細胞表達均高于假手術組(P＜ 0.05)；中藥+G-CSF組與G-CSF組均明顯高于模型組(P＜0.01)；中藥+G-CSF組高于G-CSF組(P＜0.05)。見表1、圖2。

表1 各組心肌梗死邊緣區CD34陽性細胞表達(IOD)

2.3 VEGF陽性細胞

心肌VEGF陽性細胞存在于胞漿，陽性染色多數位于心肌梗死邊緣區，也有部分位于心肌內膜區，考慮可能是由于時間窗的影響。假手術組有少量陽性細胞表達。模型組、中藥+G-CSF組、G-CSF組VEGF陽性細胞表達均高于假手術組(P＜0.05)；中藥+G-CSF組、G-CSF組VEGF陽性細胞表達高于模型組(P＜ 0.05)；中藥+G-CSF組VEGF陽性細胞表達顯著高于G-CSF組(P＜0.001)。見表2、圖3。

表2 各組心肌梗死邊緣區VEGF陽性細胞表達(IOD)

2.4 Ki-67陽性細胞

Ki-67抗體染色細胞核是反映處于細胞周期中增殖狀態細胞的理想標志物[7]。Ki-67陽性細胞染色顯示，模型組梗死區細胞漿溶解，但仍可見蘇木素復染的細胞核陽性表達。假手術組未見梗死區，陽性細胞數量少，Ki-67表達弱；模型組、中藥+G-CSF組、G-CSF組Ki-67陽性細胞表達均顯著高于假手術組(P＜ 0.001)；中藥+G-CSF組與G-CSF組Ki-67陽性細胞表達均高于模型組(P＜0.05)；中藥+G-CSF組Ki-67陽性細胞表達高于G-CSF組，但差異不具有統計學意義(P＞0.05)。見表3、圖4。

表3 各組大鼠心肌梗死邊緣區Ki-67陽性細胞數百分比

圖1 各組心肌組織HE染色(200×)

圖2 各組心肌組織CD34陽性細胞免疫組化染色(400×)

圖3 各組心肌組織VEGF陽性細胞免疫組化染色(400×)

圖4 各組心肌組織Ki-67陽性細胞免疫組化染色(400×)

3 討論

在既往的研究中，可能有利于心肌微環境的構成因素并不單一。在MRL小鼠鏈中，多個基因位點導致一些器官再生能力的提高。在這些小鼠中有時可以觀察到幾個有力的機制聯合在一起導致心臟再生能力的提高，包括血管形成和細胞增殖的增加，凋亡和纖維化的減少[11]。研究表明，AM I發生后，CD34陽性細胞移植能促進缺血、梗死的心肌細胞再生以及血管新生[12-14]。CD34陽性細胞在向受損區域歸巢后，開啟了可以滋養心肌細胞的旁分泌系統，即可以通過分泌細胞因子如VEGF、腫瘤壞死因子α等，來調節損傷局部的微環境，刺激內源性干細胞樣細胞/祖細胞的增殖和分化[15]，降低炎癥反應[16-18]和免疫反應[19]，從而促進受損組織的再生修復能力。VEGF除了由歸巢干細胞的旁分泌功能產生以外，缺氧壞死的心肌組織細胞也可產生，并參與損傷后的炎癥反應和組織修復。除此之外，VEGF還有通過動員機體的干細胞參與心臟修復的功能[20]。CD34陽性細胞與VEGF的交叉功能可視為強有力的聯合機制。

本實驗結果顯示，心肌梗死邊緣區存在大量CD34陽性細胞浸潤和VEGF陽性細胞浸潤。提示以CD34陽性細胞及VEGF陽性細胞作為靶點調節梗死微環境，可以有效促進修復。

結扎冠狀動脈前降支的大鼠，血道閉塞血脈不通，瘀血阻滯脈絡，以 “血氣不至”、“血凝而不流”、“血瘀滯不行”等為主要病理機制，證型為心血瘀阻型[21]。既往的研究也為實驗造模的大鼠具有急性心肌梗死心血瘀阻證的中醫證候特點提供了證據[8]。

本課題使用主要成分為三七總皂苷的血塞通作為中藥干預，取其活血祛瘀、通脈活絡之性，意在采取活血化瘀法隨證治之，使 “疏其氣血，令其條達”。我們在實驗中觀察到，模型組大鼠皮膚顏色蒼白、紫暗，活動減少、活躍度降低。經過藥物治療，中藥+ G-CSF組與其他組對比，大鼠皮膚顏色紅潤，行為也比較活躍。中藥+G-CSF組VEGF陽性細胞染色、CD34陽性細胞染色均高于G-CSF組(P＜0.05)。此結果驗證了活血化瘀藥影響微環境對心臟的修復有促進功能。

本實驗采取活血化瘀法，一方面通過化瘀、化舊等方法來祛除體內沉積的瘀血及其他陳舊性的病理產物，另一方面強調活血、生血[22]。實驗研究證明，具有活血祛瘀功效的牛膝精能促進CD34陽性細胞的增殖分化，考慮該作用可能與改善造血組織的微環境有關[23]。王宗仁等發現有益氣活血功能的芪丹通脈片能夠預防急性心肌缺血，刺激心肌分泌VEGF及堿性成纖維細胞生長因子[24]。本實驗中，中藥+G-CSF組Ki-67陽性細胞多于G-CSF組，但無顯著性差異(P＞0.05)。因此推測，以活血化瘀法影響CD34、VEGF來調整微環境促進梗死心肌修復，具有一定意義的治療作用。AM I后微環境的其他作用靶點及從更深層次的基因層面論證活血化瘀法的療效等值得更進一步的研究。

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書訊

《特殊兒童教育與康復文庫》已由南京師范大學出版社出版。本文庫系國家出版基金項目、國家 “十二五”重點圖書出版規劃項目，由顧明遠、張海迪任總顧問，樸永馨、林寶貴、方俊明、勵建安、貝維斯、卓大宏等任各分冊學術顧問，南京特殊教育師范學院丁勇任總主編，勵建安、李曉捷、陳小娟、許家成、杜曉新、黃冬、盛永進、何侃等任分冊主編。

本文庫分為 “特殊兒童教育系列”與 “特殊兒童康復系列”兩個子系列共20分冊。“特殊兒童教育系列”包括《殘疾兒童權利與保障》《特殊兒童教育導論》《特殊兒童教育評估》《特殊兒童早期發展支持》《特殊兒童溝通與交往》《特殊兒童認知訓練》《特殊兒童行為管理》《特殊兒童生活教育》《特殊兒童體育與運動》《特殊兒童生涯發展與轉銜教育》。“特殊兒童康復系列”包括《特殊兒童康復概論》《特殊兒童物理治療》《特殊兒童作業治療》《特殊兒童語言與言語治療》《特殊兒童心理治療》《特殊兒童藝術治療》《特殊兒童舞動治療》《特殊兒童功能性視力訓練》（附DVD光盤）《特殊兒童定向行走訓練》《特殊兒童輔助技術》。

本文庫倡導與心理、教育相結合的康復理念；強調家庭、社區、學校(康復機構)的配合協作；注重運用多種手段進行綜合康復，以幫助殘障兒童盡可能像健全兒童那樣學習和生活。圖文并茂，操作性強，適用面廣，讀者群大，可供各類、各級殘疾兒童教育機構教育與研究工作者、各級康復機構服務人員、殘疾兒童及其他特殊需要兒童家長以及其他從事相關工作的人員參考。

精裝總定價：1200元(20冊)，平裝總定價：880元(20冊)。總編辦電話：025-83598919，營銷部電話：025-83598712/83598412，郵購部電話：025-83598297，網址：http://www.njnup.com，郵箱：nspzbb@163.com，聯系地址：南京市寧海路122-1號，郵政編碼：210097。

Effect of Activating Blood to Resolve Stagnation on Cells Expressing CD34and Vascular EndothelialGrow th Factor in Ratswith Acute Myocardial Infarction

SHIWei1,LIYe-zi2,ZHAOHai-bin2,YANG Dan-dan2,JIANG Tian-yuan2,LIDong-fang2,ZHAIYao-yao2
1.Health Bureau of Chaoyang District,Beijing 100026,China;2.Department of Cardiology,the Third A ffiliated Hospitalof Beijing University of ChineseMedicine,Beijing 100029,China

Objective To explore the effectof Activating Blood to Resolve Stagnation on the expression of CD34and vascular endothelialgrow th factor(VEGF)in ratswith acutemyocardial infarction.Methods32Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham operation group(A,n=8),model group(B,n=8),Xuesaitong Injection+granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)group(C,n=8)and G-CSF group(D,n=8).Correspondingmedicinewas given to each group 3 hours aftermodeling,for 6 days.Pathomorphological changes wereobserved through HE staining,and theexpression of CD34,VEGFand Ki-67wereobserved through immunohistochemicalstaining.Results The expressions of CD34,VEGF and Ki-67 were higher in groups B,C and D than in group A(P＜0.05),and were higher in group groups C and D than in group B(P＜0.05).The expressions of CD34and VEGFwere higher in group C than in group D(P＜0.05).However, therewasno significantdifference in the expression of Ki-67 between 2 groups(P＞0.05).Conclusion Theexpression of CD34and VEGF increaseswith Activating Blood to Resolve Stagnationmethod,which is superior to using G-CSF only.Activating Blood to Resolve Stagnationmay play an important role in the treatmentof acutemyocardial infarction.

acutemyocardial infarction;marrow stem cells;vascular endothelial grow th factor;micro environment;Activating Blood to Resolve Stagnationmethod

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.08.005

R541.4

A

1006-9771(2015)08-0894-06

2015-02-05

2015-04-27)

北京中醫藥科技項目(No.JJ2011-67)。

1.北京市朝陽區衛生局，北京市100026；2.北京中醫藥大學第三附屬醫院心內科，北京市100029。

師偉(1960-)，男，漢族，河北東光縣人，博士，主任醫師，主要研究方向：疾病預防控制工作。通訊作者：趙海濱，男，博士，教授。E-mail:haibin999@126.com。