miRNA-143靶向MACC1抑制宮頸癌細胞侵襲

許常娟 鄧丹玲 丁彥青 廖雯婷

·基礎研究·

miRNA-143靶向MACC1抑制宮頸癌細胞侵襲

許常娟 鄧丹玲 丁彥青 廖雯婷

目的：探討miRNA-143對宮頸癌細胞侵襲能力的影響。方法：采用脂質體轉染法瞬時轉染miRNA-143過表達和干擾質粒，Transwell遷移實驗檢測miRNA-143過表達和抑制后宮頸癌細胞侵襲能力的改變，生物信息學預測miRNA-143的作用靶點。miRNA-143過表達和抑制后Western blot及雙熒光素酶報告基因檢測其靶點MACC1表達，RT-qPCR檢測20例患者宮頸癌和癌旁正常組織標本中miRNA-143和MACC1 mRNA的表達，分析20例患者宮頸癌組織中miRNA-143和MACC1 mRNA表達的相關性。結果：Transwell遷移實驗顯示miRNA-143過表達的宮頸癌細胞的侵襲能力降低，抑制miRNA-143后侵襲能力增強。生物信息學預測顯示miRNA-143作用于MACC1的3'-UTR，Western blot及雙熒光素酶報告基因結果進一步證實miRNA-143作用于MACC1的3'-UTR。RT-qPCR顯示miRNA-143過表達的MACC1 mRNA表達下降，而抑制miRNA-143后MACC1 mRNA表達上升。抑制miRNA-143表達的宮頸癌細胞中MACC1被干擾后，宮頸癌細胞的侵襲能力顯著被抑制。宮頸癌組織中miRNA-143表達水平顯著低于正常宮頸上皮組織，MACC1表達水平顯著高于正常宮頸上皮組織，20例患者的宮頸癌組織中miRNA-143與MACC1 mRNA表達呈負相關。結論：miRNA-143在宮頸癌中表達水平下降，并可能通過靶向MACC1調節宮頸癌細胞的侵襲能力。

宮頸癌 miRNA-143侵襲 MACC1

宮頸癌（cervical cancer）是女性常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康。宮頸癌發病的高危因素主要為人乳頭瘤病毒（human papillomaviruses，HPVs）感染，大部分宮頸癌患者體內可檢測到HPV DNA。

在發展中國家，盡管宮頸癌細胞學篩查的廣泛開展使宮頸癌的發生率和死亡率有所下降，但其發生率和死亡率仍居女性惡性腫瘤的第2位。因此，宮頸癌應成為女性重點預防的惡性腫瘤。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）與多種惡性腫瘤的發生和轉移密切相關［1-2］。在宮頸癌中已發現數種表達失調的miRNA，包括miRNA-21、miRNA-126等［3］。近期有研究發現，miRNA-143在宮頸鱗癌中表達下調，其表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移及HPV16的感染密切相關［4］。然而，miRNA-143在宮頸癌中作用和分子機制尚在研究中。本研究旨在探討miRNA-143在宮頸癌細胞侵襲中的作用，并初步探討其分子機制，明確miRNA-143是否通過靶向MACC1而調控宮頸癌的侵襲轉移，為宮頸癌轉移的臨床干預治療提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集2012年12月至2013年10月取自南方醫科大學附屬南方醫院20例手術患者的宮頸癌和癌旁正常組織標本，標本置于液氮保存。患者標本使用獲得本院倫理委員會認可。

1.1.2 細胞株 人宮頸癌細胞株SiHa和Caski為南方醫科大學病理學實驗室自存。

1.1 3 實驗試劑 胎牛血清、RPMI 1640（美國Gibco公司），反轉錄試劑盒、Taq HS酶、Trizol試劑（日本Taraka公司），LipofectamineTM2000試劑盒（美國Invit?rogen公司），PVDF膜（美國Millipor公司），miRNA-143過表達、miRNA-143抑制和All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR檢測試劑盒（美國Genecopoeia公司），雙熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega公司），Snail兔抗人單克隆抗體（美國Cell signaling公司），Transwell小室（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人宮頸癌細胞株SiHa和Caski在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，37℃、5% CO2的條件下培養。取對數生長期細胞接種于6孔板，設置陰性對照（negative control，NC）轉染組、miR?NA-143過表達和miRNA-143轉染抑制組。基因轉染步驟參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行，轉染后48 h裂解細胞，收集RNA和蛋白分別進行下一步檢測。

1.2.2 組織總RNA提取 取新鮮宮頸癌及癌旁正常組織，在液氮中研磨后加Trizol試劑裂解，按常規方法提取組織RNA，并測定RNA濃度。

1.2.3 RT-qPCR檢測組織及細胞中miRNA-143表達 采用miRNA逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄，利用特異的引物，進行RT-qPCR檢測。反應條件為50℃2 min、95℃10 min、95℃15 s、60℃1 min、72℃34 s，共行40個循環。反應結束后得到Ct值。根據公式2-（miRNA-143的Ct值－U6的Ct值）計算目的基因相對含量，實驗重復3次。

1.2.4 Transwell遷移實驗 細胞轉染24 h后消化、計數，加入放置Transwell小室的24孔板中，上層小室加入含5%胎牛血清的培養基，下層加入含20%胎牛血清的培養基，孵育48 h后取出、固定、染色，顯微鏡下隨機選取視野拍照計數，實驗重復3次。

1.2.5 Western blot法檢測 miRNA-143過表達或抑制后MACC1表達采用陽離子脂質體Lipofectami?neTM2000瞬時轉染MACC1的干擾序列shMACC1#1和shMACC1#2，48 h后提取細胞總蛋白，蛋白采用10% SDS-PAGE凝膠行電泳分離，濕轉法轉印至PVDF膜上，結束后使用兔抗人的MACC1單克隆抗體孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗，于室溫孵育45 min后洗脫抗體，常規顯色發光。

1.2.6 載體構建PGL3-MACC1的3'-UTR-WT 以人宮頸癌細胞基因組DNA為模板，擴增MACC1的3'-UTR，將該片段克隆至PGL3-Basic載體，經質粒轉化、小量提取、測序鑒定得到種族質粒PGL3-MACC1的3'-UTR-WT。

1.2.7 設計重組質粒PGL3-MACC1的3'-UTR突變體 以人宮頸癌細胞基因組DNA為模板，擴增突變序列，將突變序列片段克隆至PGL3-Basic載體，經雙酶切、連接、轉化、搖菌、質粒提取、測序鑒定得到突變質粒PGL3-MACC1的3'-UTR-MUT。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測實驗 SiHa轉染前24 h消化和計數細胞，在24孔板中接種5×104/mL細胞，待細胞達到60%匯合進行轉染。按Lipofectami?neTM2000說明書操作。轉染分為過表達+PGL3-Basic載體、過表達+3'-UTR-WT、過表達+3'-UTR-MUT組，設3個復孔。轉染后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理。兩組計量資料采用非參數Wilcoxon符號秩檢驗，均數比較采用獨立樣本t檢驗，各組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌細胞中miRNA-143過表達和抑制后表達

RT-qPCR結果顯示，與陰性對照轉染組比較，在宮頸癌SiHa細胞中瞬時轉染過表達miRNA-143，miRNA-143表達升高，陰性對照轉染組和miRNA-143過表達組的差異具有統計學意義（P=0.002）；在宮頸癌Caski細胞中轉染抑制miRNA-143，miRNA-143表達明顯下降，陰性對照轉染組和miRNA-143轉染抑制組的差異具有統計學意義（P=0.001），見圖1。

2.2 miRNA-143過表達和抑制后宮頸癌細胞侵襲遷移能力的改變

Transwell遷移實驗結果顯示，與陰性對照組相比，宮頸癌SiHa細胞的miRNA-143過表達使遷移的細胞明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.001，圖2A）；在宮頸癌Caski細胞中抑制miRNA-143后遷移的細胞明顯增多，差異具有統計學意義（P＜0.001，圖2B）。miRNA-143過表達使細胞的遷移能力明顯減弱，而抑制miRNA-143后細胞的遷移能力明顯增強。

2.3 miRNA-143作用靶點的預測及驗證

miRNA靶基因預測軟件Target Scan發現miRNA-143能作用于MACC1的3'-UTR（圖3A）；雙熒光素酶報告基因實驗顯示共轉染重組質粒MACC1的3'-UTRMUT、MACC1的3'-UTR-WT以及miRNAs后，與MACC1的3'-UTR-MUT相比，MACC1的3'-UTR-WT和miRNAs共轉染后MACC1的熒光素酶活性降低，差異具有統計學意義（P=0.002，圖3B）；RT-qPCR檢測發現miRNA-143過表達使MACC1表達明顯下降，反之抑制miRNA-143后MACC1表達升高（圖3C）。

2.4 MACC1介導miRNA-143調節宮頸癌細胞的侵襲能力

宮頸癌Caski細胞中轉染miRNA-143抑制劑后轉染MACC1的干擾序列shMACC1#1和shMACC1#2，并觀察其侵襲能力的改變。結果發現，miRNA-143均能有效抑制細胞中MACC1表達（圖4A）；MACC1的表達被抑制后，細胞的侵襲能力顯著減弱（圖4B）。

圖1 RT-qPCR檢測轉染miRNA-143過表達和抑制后表達Figure 1 RT-qPCR was used to test the expression of miRNA-143 after transfection with miRNA-143 mimics and inhibitor

圖2 Transwell遷移實驗檢測miRNA-143過表達和抑制后宮頸癌細胞遷移能力的改變（H&E×20）Figure 2 Transwell invasion assay was used to detect the migration in cervical cancer cells after miRNA-143 over-expression or knockdown(H&E×20)

圖3 驗證miRNA-143的作用靶點及檢測MACC1的改變Figure 3 Verification of miRNA-143 target and measurement of MACC1 expression

圖4 MACC1介導miRNA-143調節宮頸癌細胞的遷移能力（H&E×20）Figure 4 MACC1 is necessary for the regulation of miRNA-143 in the invasion of cervical cancer（H&E×20）

2.5 miRNA-143與MACC1在宮頸癌組織中表達水平的檢測

RT-qPCR檢測結果顯示，20例患者的宮頸癌組織中miRNA-143相對表達的中位數為2.078 7，而癌旁正常組織中miRNA-143相對表達中位數為3.546 8，采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗，癌組織中miRNA-143表達量明顯降低，兩者差異具有統計學意義（P＜0.001，圖5A）；癌組織中MACC1相對表達的中位數為0.423 7，而癌旁正常組織中MACC1相對表達中位數為0.187 3，采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗，癌組織中MACC1表達量明顯升高，兩者差異具有統計學意義（P＜0.001，圖5B）。進一步采用免疫組織化學法對MACC1的表達進行驗證，發現MACC1主要在胞漿內表達，且MACC1在宮頸癌組織中表達明顯高于癌旁組織（圖5C、D）。采用Spearman分析發現，20例患者的宮頸癌組織中miRNA-143表達與MACC1 mRNA表達水平呈負相關（r=-0.615，P= 0.004，圖5E）。

圖5 20例患者的宮頸癌組織及癌旁正常組織中miRNA-143與MACC1表達及相關性分析Figure 5 Correlation analyses of miRNA-143 and MACC1 expression in the primary cervical cancer and para-neoplastic normal tissues of 20 patients

3 討論

隨著世界范圍內宮頸細胞學篩查的廣泛應用，目前宮頸癌的發病率和死亡率均呈現下降趨勢。此外，針對HPV的宮頸癌預防性腫瘤疫苗的開發和臨床應用，使未來20～30年間宮頸癌將可能得到有效的控制。但是，目前宮頸癌的治療策略尚未取得較大進展，尤其是針對晚期伴有轉移的宮頸癌患者。因此，積極探索宮頸癌發生發展和轉移的分子機制具有重要的現實價值和理論意義。

miRNA-143定位于人類染色體5q32脆弱位點，成熟序列為5′-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3′，其在多種實體瘤中表達下調或缺失，包括結直腸癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌和B細胞淋巴瘤等［5］。研究報道，miRNA-143的靶點基因包括KRAS、MACC1和Bcl-2等［6-8］，這些基因參與了ERK和MAPK信號通路，其中Stein等［9］證實MACC1是HGF-cMet信號通路中的一個關鍵調節因子，可以顯著上調cMet蛋白的表達，促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移。該研究已證實MACC1基因與HGF-cMet信號通路之間呈正相關，HGF促進MACC1入核，MACC1啟動cMet基因轉錄，導致cMet蛋白總量表達增加，進而結合更多的HGF分子，從而增強HGF-cMet信號通路活性。

Lajer等［10］發現miRNA-143/miRNA-145可能參與宮頸癌HPV相關的病變過程。Wang等［11］發現miRNA-143在宮頸癌組織中表達下調，在宮頸癌HeLa細胞中miRNA-143過表達能抑制細胞增殖。然而，miRNA-143在宮頸癌細胞侵襲中作用尚不清楚。本研究結果提示，miRNA-143在宮頸癌中表達下調，在宮頸癌細胞中miRNA-143過表達能抑制宮頸癌細胞的侵襲能力，并下調MACC1表達；反之在宮頸癌細胞中抑制miRNA-143表達，則能增強宮頸癌細胞的侵襲能力，并上調MACC1表達。MACC1是一個與結腸癌浸潤轉移密切相關的基因，在調節細胞增殖、運動和遷移等方面發揮著重要的作用［12］。目前已證實MACC1基因是HGF-cMet信號通路的一個關鍵調節因子，MACC1在腫瘤的發生、發展和轉移過程中起了十分重要的作用［9］。有研究表明，MACC1在宮頸癌中表達水平升高［13］，然而其調控機制尚未明確。本研究結果表明MACC1的轉錄水平和蛋白水平表達均在宮頸癌組織中升高，與之前文獻報道的結果相符［13］。同時，本研究證實在宮頸癌細胞中miRNA-143能靶向作用于MACC1的3'-UTR，下調MACC1表達。進一步的研究顯示，在宮頸癌組織中miRNA-143與MACC1表達呈負相關。這些結果提示，在宮頸癌中miRNA-143可能通過直接作用于其靶分子MACC1從而抑制宮頸癌細胞的侵襲。

綜上所述，本研究結果表明miRNA-143在宮頸癌組織中低表達，miRNA-143能調控MACC1從而抑制宮頸癌細胞的侵襲，為miRNA作為宮頸癌轉移新的標志物提供科學依據，對于宮頸癌轉移的臨床干預治療具有重要意義。

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（2015-07-01收稿）

（2015-09-09修回）

Inhibitory effect of miRNA-143 on the invasiveness of cervical cancer cells by targeting MACC1

Changjuan XU,Danling DENG,Yanqing DING,Wenting LIAO

Department of Pathology,Southern Medical University School of Basic Medical Sciences,Guangzhou 510515,China

Objective:To illustrate the role of miRNA-143 on the invasiveness of cervical cancer cells.Methods:MiRNA-143 mimics or inhibitor sequences were transiently expressed in the cervical cancer cells by liposome transfection.Transwell assay was applied to test the invasive ability of cervical cancer cells after miRNA-143 over-expression or inhibition.Bioinformatics assay was used to predict the targets of miRNA-143.RT-qPCR and luciferase reporter assay were performed to detect the expression of MACC1 mRNAin the cancer cells.RT-qPCR was conducted to test the expression of miRNA-143 and MACC1 mRNAin 20 fresh primary cervical cancer and their matched para-neoplastic tissues.Statistical analyses were performed to evaluate the association between the expression of miRNA-143 and MACC1 mRNA in the 20 cases of cervical cancer.Results:Transwell assays revealed that the miRNA-143 over-expression inhibited the cell invasiveness,while miRNA-143 inhibition promoted the invasive ability of the cervical cancer cells. Bioinformatics analyses revealed that miRNA-143 could target the 3'-UTR of MACC1.Dual luciferase reporter assay confirmed that miRNA-143 can affect 3'-UTR sequence in MACC1 genes.RT-qPCR analyses indicated that the expression of MACC1 mRNA was obviously down-regulated after miRNA-143 over-expression,while significantly increased after the miRNA-143 inhibition.The migration in Caski/miRNA-143 inhibitor cells was obviously elevated after being transfected with MACC1 shRNAs.RT-qPCR analyses showed that the expression of miRNA-143 was obviously decreased in the cancer tissues compared with the normal tissues,while MACC1 mRNA was apparently decreased in cancer tissues compared with the normal ones.Statistical analyses revealed that miRNA-143 was negatively correlated with MACC1 mRNA in the 20 cases of cervical cancer.Conclusion:This study reveals that miRNA-143 is downregulated in the cervical cancer tissues.MiRNA-143 may play an important role in the regulation of cell invasiveness by targeting MACC1 in the cervical cancer cells.

cervical cancer,miRNA-143,invasiveness,MACC1

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.18.709

南方醫科大學基礎醫學院病理系（廣州市510515）

廖雯婷 liaowt2002@gmail.com

許常娟 專業方向為腫瘤病理學。

E-mail：15629906@qq.com