兩步鹽析聯合雙水相萃取提取純化藍藻中藻藍蛋白

張發宇，趙冰冰，陳 裕，袁夢媛，汪家權*

（合肥工業大學資源與環境工程學院，安徽 合肥 230009）

兩步鹽析聯合雙水相萃取提取純化藍藻中藻藍蛋白

張發宇，趙冰冰，陳 裕，袁夢媛，汪家權*

（合肥工業大學資源與環境工程學院，安徽 合肥 230009）

以巢湖新鮮藍藻為處理對象，采取凍融破壁的方式獲取藻藍蛋白的粗提液，采取兩步鹽析聯合雙水相萃取的方法提取純化藻藍蛋白。運用0.618法選點實驗研究了兩步鹽析中(NH4)2SO4飽和度對提取純化影響，構建了聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-(NH4)2SO4的雙水相體系，綜合考慮PEG相對分子質量、PEG質量分數、(NH4)2SO4質量分數、pH值和藻藍蛋白質量濃度對提取純化藻藍蛋白的影響。結果表明：室溫25 ℃條件下，一步鹽析時(NH4)2SO4的最佳飽和度為21%，二步鹽析時(NH4)2SO4的最佳飽和度為30%。兩步鹽析后得到的藻藍蛋白構建成PEG-(NH4)2SO4的雙水相體系后，當PEG相對分子質量1 000、PEG 1 000質量分數10%、(NH4)2SO4質量分數25%時，藻藍蛋白的純度可達3.45。

兩步鹽析；雙水相萃取；提取純化；藻藍蛋白

富營養化是指由于人類的活動，水體中營養物質增加（一般是氮、磷的化合物），引起浮游植物過量生長和整個水體生態平衡的改變，因而造成危害的一種污染現象[1]。其結果是引起水質惡化、溶解氧耗竭、透明度降低、漁業減產、阻塞航道，對人和動物產生毒性等。這種現象在江河湖泊中稱為“水華”，在海洋 則稱為“赤潮”。水華的發生不僅制約了湖泊水資源的可利用行，而且直接危害人類的健康生存和社會經濟的可持續發展[2]。

湖泊中富營養化主要表現形式為藍藻爆發，水華污染嚴重。目前，對水華藍藻資源化研究較多是藍藻產沼氣和用作低端肥料[3]，產品附加值低，經濟效益不高，要實現新鮮藍藻的資源化，從中提取高附加值藻藍蛋白的資源化路線，最為符合目前經濟社會需求。很多研究表明高純度藻藍蛋白具有良好的功效，如抗炎性[4]、抗癌性[5]、抗衰老性[6]、抗氧化性[7-8]、免疫熒光性[9-10]等。水華藍藻中藻藍蛋白的含量達5%以上[11]，從水華藍藻中提取純化純天然的藻藍蛋白既能達到消除污染的目的，又可實現經濟效益的最大化。

提取純化藻藍蛋白的研究[12-19]較多，實驗選擇以反復凍融破壁的方式獲得藻藍蛋白粗提液，在此基礎上研究鹽析法聯合雙水相萃取法提取純化藻藍蛋白的最優組合條件。根據前期破壁藍藻獲取藻藍蛋白的實驗結果[20]，選用了反復凍融破壁提取藻藍蛋白粗提液。另外，因為鹽析法具有應用成熟、材料來源廣泛、易于工業化等優點。雙水相萃取不僅條件溫和、容易放大、可連續操作，還能使目標蛋白的純度得到較大提升，現已被廣泛用于蛋白質、核酸、氨基酸、多肽、細胞器等產品的分離和純化[21-22]。因此選用鹽析法聯合雙水相萃取法提取純化藻藍蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮藍藻藻泥采自巢湖西湖區水華暴發表層20 cm水體，含水量約為96.2%，采集日期為2013年8月9日，采樣期間天氣晴朗，室外氣溫37～38 ℃。藍藻采集后運回實驗室放入冰柜內貯存備用。

(NH4)2SO4、NaOH 廣東西隴化工股份有限公司；NaCl 天津市致遠化學試劑有限公司；硫酸 上海振企化學試劑有限公司；乙醇 上海蘇懿化學試劑有限公司；所有試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV/VΙS-1950型紫外-可見分光光度儀 北京普析通用公司；85-2A型恒溫攪拌器 江蘇金城國勝儀器廠；KDC-160HR型低溫高速離心機 安徽中科中佳儀器公司；BC/BD-718DTF型冷柜 天長市天一電器有限公司。

1.3 方法

主要表現為呼吸道癥狀和神經癥狀。雛雞表現明顯的呼吸困難，呼吸時張口伸頸，氣喘，發出“呼嚕”聲，咳嗽，口中有粘液，有搖頭和吞咽動作，并出現死亡。一周左右大部分病雞出現好轉，少數雞出現扭頸、歪頭，頭向后仰，共濟失調等神經癥狀，安靜時恢復常態，稍遇刺激，反復發作，成年產蛋雞表現輕微，產蛋率下降10%～30%，同時蛋的品質下降。

1.3.1 各指標的計算

藻藍蛋白在620 nm波長處有特征吸收峰，蛋白在280 nm波長處有最大吸收峰，藻藍蛋白的純度（P）測量參考Herrera等[23]推薦的公式，藻藍蛋白質量濃度（ρ）、得率（Q）參考Soni等[24]的推薦公式，藻藍蛋白在雙水相中的分配系數（K）、在上相中的回收率（Y）參見文獻[25]。

藻藍蛋白純度見公式（1）：

藻藍蛋白質量濃度見公式（2）：

藻藍蛋白得率見公式（3）：

藻藍蛋白分配系數見公式（4）：

式（1）～（5）中：A280nm、A620nm、A650nm分別為波長280、620、650 nm處的吸光度；V為藻藍蛋白體積/mL；m為藻泥質量/g；k1為藻藍蛋白稀釋倍數；k2為藻泥中藍藻干物質的質量分數/%；Ct、Cb分別為雙水相體系中上下相的藻藍蛋白質量濃度/（g/L）；R為雙水相中上下相的體積比。

1.3.2 藻藍蛋白粗提液的制備

取冷凍保存的含水率為9 6.2%的巢湖新鮮水華藍藻，反復凍融3次。取解凍后的藍藻于4 ℃、8 000 r/min離心20 min，上清液過4 層普通紗布，即可得到藻藍蛋白粗提液。

1.3.3 兩步(NH4)2SO4鹽析

根據0.618法的原理，在10%～60%的(NH4)2SO4飽和度范圍內，進行一步鹽析：分別向1.3.2節中所取得藻藍蛋白粗提液中緩慢加入(NH4)2SO4，以防止溶液局部質量濃度過高導致蛋白質變性。(NH4)2SO4的飽和度調節至17%、19%、20%、21%、22%、24%、29%、41%共8 組。溶解后4 ℃、8 000 r/min離心20 min，傾倒上清液，測定藻藍蛋白純度和得率。根據0.618法的原理，在(NH4)2SO4飽和度為21%～70%范圍內，進行二步鹽析：將1.3.2節取得藻藍蛋白粗提液經一次鹽析，即(NH4)2SO4飽和度調至21%，離心，取上清液備用。分別將備用液中(NH4)2SO4的飽和度追加至28.16%、29.28%、29.8%、30.4%、30.92%、32.56%、35.32%、39.72%、51.28%共9 組。溶解后4 ℃、8 000 r/min離心10 min，沉淀用磷酸緩沖溶液（0.002 5 mol/L）溶解后測藻藍蛋白純度和得率。

1.3.4 光譜圖繪制

藻藍蛋白粗提液經250～700 nm波長范圍掃描，發現藻藍蛋白在620 nm波長處有特征吸收峰，在280 nm波長處有最大吸收峰，經計算藻藍蛋白粗提液純度0.426，光譜圖如圖1所示。

圖1 藻藍蛋白紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-visible absorption spectrum of phycocyanin

1.3.5 正交試驗因素與水平設計

兩步鹽析實驗的基礎上，獲得了純度為1.969的藻藍蛋白溶液。考慮該溶液中有部分(NH4)2SO4剩余，因此直接建立起聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-(NH4)2SO4雙水相體系，綜合考慮PEG相對分子質量、PEG質量分數、(NH4)2SO4質量分數、pH值和藻藍蛋白質量濃度的影響，以藻藍蛋白純度為衡量指標，了解雙水相分層的情況，以此探索雙水相體系的效果，按照L16（54）建立正交試驗，影響因素及水平如表1所示。

表1 PEG-((NNHH4)2SSOO4正交試驗影響因素及水平Table1 Factors and levels used in orthogonal array experiments on aqueous PEG--((NNHH4)2SSOO4two-phase systteemm

2 結果與分析

2.1 一步鹽析單因素試驗結果

在室溫25 ℃條件下，在10%～60%的(NH4)2SO4飽和度范圍內，依據1.3.3節步驟進行實驗，與一些鹽析法較粗放選取單因素試驗點相比[26]，最終根據0.618法的原理精細選取了(NH4)2SO4飽和度為17%～41%，即圖2中1～8實驗序號點，測定上清液中藻藍蛋白純度和得率。

圖2 一步鹽析((NNHH4)2SSOO4飽和度對藻藍蛋白純度和得率的影響Fig.2 Effect of different degrees of ammonium sulfate saturation on phycocyanin purity and yield in the fi rst salting-out prec ipitation

圖2 為一步鹽析時，藻藍蛋白純度和得率在(NH4)2SO4飽和度為10%～60%之間的變化情況。當(NH4)2SO4飽和度在10%～21%時，上清液中藻藍蛋白純度和得率均呈上升趨勢，在(NH4)2SO4飽和度為21%即實驗序號為第4點時，藻藍蛋白純度和得率分別達到和接近最大值，分別為0.519和3.47%，當(NH4)2SO4飽和度大于24%后純度明顯下降，得率逐步下降。因此，一步鹽析時(NH4)2SO4的最佳飽和度為21%。

2.2 二步鹽析單因素試驗結果

在室溫25 ℃條件下，依據1.3.3節步驟進行實驗，精細追加(NH4)2SO4的飽和度至28.16%～51.28%共9個實驗序號點，得到的藻藍蛋白沉淀經溶解后測藻藍蛋白純度和得率。

圖3 二步鹽析((NNHH4)2SSOO4飽和度對藻藍蛋白純度和得率的影響Fig.3 Effect of different degrees of ammonium sulfate saturation on phycocyanin purity and yield in the second salting-out precipitation

圖3 表明，當(NH4)2SO4飽和度為21%～29.8%時，沉淀中藻藍蛋白的純度和得率均呈上升趨勢，在(NH4)2SO4飽和度為29.8%時，沉淀中藻藍蛋白的純度和得率分別達到和接近最大值，為1.969和2.95%。當(NH4)2SO4飽和度大于29.8%時純度開始下降。因此，二步鹽析可選取(NH4)2SO4飽和度為30%即實驗序號為第3點時，即可得到最優提取純化效果。

2.3 正交試驗結果

表2 PEC-(NH4)2SOSO4雙水相正交試驗結果Table2 Results of orthogonal array experiments of aqueous PEGG--((NNHH4)2SSOO4two-phase system

由表2可以看出，各因素對純度的影響大小為PEG相對分子質量＞PEG質量分數＞藻藍蛋白質量濃度＞pH值＞(NH4)2SO4質量分數。主要影響因素是PEG相對分子質量，其他4 個因素影響并不明顯。PEG-(NH4)2SO4雙水相最優萃取條件為PEG相對分子質量1 000、PEG質量分數10%、藻藍蛋白質量濃度2 g/L、pH 6、(NH4)2SO4質量分數15%，上相中得到純度為2.619的藻藍蛋白液。另外發現當選用PEG 1 000-(NH4)2SO4構建雙水相體系時，上相藻藍蛋白的純度基本上均有上升，分配系數較大，并且藻藍蛋白的回收率較大，能起到較好的提取純化藻藍蛋白的作用。

2.4 PEG 1 000-(NH4)2SO4雙水相萃取實驗結果

由2.3節正交試驗可知，構建PEG 1 000-(NH4)2SO4雙水相體系對提取純化藻藍蛋白有很好的效果，為此進一步進行PEG 1 000-(NH4)2SO4單因素試驗，了解PEG 1 000與(NH4)2SO4質量分數對純化后藻藍蛋白純度的影響。

因此，選取新一批巢湖藍藻藻泥，進行凍融破壁處理，按照一步鹽析和兩步鹽析方法，得到純度為2.653的藻藍蛋白液。構建PEG 1 000-(NH4)2SO4雙水相體系，選取(NH4)2SO4質量分數為20%不變，進行PEG 1 000質量分數變化對萃取藻藍蛋白純度的影響實驗。結果表明，(NH4)2SO4質量分數20%、PEG 1 000質量分數10%時，一次雙水相萃取后，藻藍蛋白純度達3.38，實驗結果如圖4所示。

圖4 PEG 1 000質量分數變化對藻藍蛋白純度的影響Fig.4 Effect of different PEG 1 000 mass fractions on phycocyanin purity

另外，選定PEG 1 000質量分數為10%不變，進行(NH4)2SO4質量分數對萃取純度的影響實驗。結果表明，(NH4)2SO4質量分數25%、PEG 1 000質量分數10%時，一次雙水相萃取后，藻藍蛋白的純度達3.45，實驗結果如圖5所示。

圖5 ((NNHH4)2SSOO4質量分數變化對藻藍蛋白純度的影響Fig.5 Effect of different ammonium sulfate mass fractions on phycocyanin purity

3 結 論

在兩步鹽析過程中，運用0.618法選取實驗點，得出了兩步鹽析過程中，最佳(NH4)2SO4飽和度分別為21%和30%。運用正交試驗法，合理初選了PEG-(NH4)2SO4的雙水相體系，該體系對提取純化藻藍蛋白有較大作用。得出結論為：藻藍蛋白粗提液經最佳(NH4)2SO4飽和度條件下的兩步鹽析后純度可達2.653。后構建PEG 1 000-(NH4)2SO4雙水相體系，當(NH4)2SO4質量分數25%、PEG 1 000質量分數10%時，上相中藻藍蛋白的純度可達3.45。實驗過程中發現了不同批次藍藻藻泥，獲取的藻藍蛋白含量不同，相應的實驗結果也有所差別，建立藻泥含固或量含藻藍蛋白量與鹽析及雙水相參數關系就變得十分重要，并且雙水相中上相的PEG去除或回收也是當前亟需解決的問題。在巢湖藍藻水華現象日益加劇的情況下，藍藻資源化應用研究，尤其是藍藻中藻藍蛋白高附加值資源化的研究緊迫并富有意義，它本身就符合循環經濟的理念。在提取純化工藝上，兩步鹽析聯合雙水相萃取能起到較好的效果，為后期實驗的開展以及生產線的建設提供了參考。

[1] 劉建康, 高級水生生物學[M]. 北京: 科學出版社, 1999: 326-330.

[2] 孔繁翔, 宋立榮. 藍藻水華形成過程及其環境特征研究[M]. 北京:科學出版社, 2011: 2-50.

[3] 韓士群, 嚴少華, 王震宇, 等. 太湖藍藻無害化處理資源化利用[J].自然資源學報, 2009, 24(3): 431-437.

[4] ROMAY C, GONZALEZ R, LEDON N, et al. C-phycocyanin: a biliprotein with antioxidant, anti-inflammatory and neuroprotective effects[J]. Current Protein and Peptide Science, 2003, 4(3): 207-216.

[5] 王勇, 錢峰, 錢凱先. 藻藍蛋白抗癌活性研究[J]. 浙江大學學報, 2001, 35(6): 672-675.

[6] 趙艷景, 湯云成. 條斑紫菜藻藍蛋白的分離純化及其抗衰老作用研究[J]. 食品科學, 2012, 33(17): 94-97.

[7] 汪興平, 謝筆均, 潘思軼, 等. 葛仙米藻藍蛋白抗氧化作用研究[J].食品科學, 2007, 28(12): 458-461.

[8] 楊立紅, 王曉潔, 鐘旭升, 等. 魚腥藻藻藍蛋白的抗氧化作用[J]. 食品科學, 2006, 27(12): 208-212.

[9] 李濟平. 藻藍蛋白對免疫系統的活性的研究[J]. 中國公共衛生, 2000, 16(7): 647-648.

[10] 吳萍. 藻膽蛋白與熒光免疫分析[J]. 生理科學進展, 2000, 31(1): 82-84.

[11] 范良民. 滇池藍藻成分分析及利用途徑探討[J]. 云南環境科學, 1999, 18(2): 46-47.

[12] 胡一兵, 胡鴻鈞, 李夜光, 等. 從一種富含藻膽蛋白的螺旋藻中大量提取和純化藻藍蛋白的研究[J]. 武漢植物學研究, 2002, 20(4): 299-302.

[13] 溫少虹, 趙呈龍, 張莉萍. 紫球藻B-藻紅蛋白的分離純化[J]. 中國海洋藥物, 2002, 82(3): 33-35.

[14] CAMREN S S, TERESA P N, ROXANA O R, et al. Extraction and purifieation of phycocyanin from Calothrix sp.[J]. Process Biochemistry, 2004, 39(12): 2047-2052.

[15] 劉楊, 王雪青, 龐廣昌, 等. 鈍頂螺旋藻藻藍蛋白的富集分離及其穩定性研究[J]. 食品科學, 2008, 29(7): 39-42.

[16] 郭靜, 王峰, 崔正剛, 等. 膨脹床-固定床層析偶聯方式分離純化藻藍蛋白[J]. 食品科學, 2013, 34(10): 107-111. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201310023.

[17] 吳蕾, 龐廣昌, 陳慶森. 螺旋藻藻藍蛋白的規模化提取和色譜純化技術研究進展[J]. 食品科學, 2008, 29(4): 461-463.

[18] KALEDONA M, MAGDALENA T, ALEKSEY T, et al. Improved procedure for separation and purification of Arihronema africanum phycobili proteins[J]. Biotechnology Letters, 2007, 29(4): 647-651.

[19] JORGE B, MARCO R. Simplified two-stage method to B-phycoerythrin recovery from Porphyridium cruentumn[J]. Joumal of Chromatography B, 2006, 844(1): 39-44.

[20] 陳裕, 張發宇, 趙冰冰, 等. 凍融超聲波聯合破壁法提取巢湖藍藻中藻藍蛋白的研究[J]. 低碳世界, 2015, 6(9): 17-18.

[21] 姜彬, 馮志彪, 陳一. PEG/鹽雙水相體系萃取小麥酯酶的研究[J]. 食品工業科技, 2008, 29(9): 200-202.

[22] 岳岑, 馮維希, 黃文, 等. 雙水相萃取法提取條斑紫菜R-藻紅蛋白工藝[J]. 食品科學, 2011, 32(16): 41-44.

[23] HERRERA A, BOUSSΙBA S, NAPOLENONE V, et al. Recovery of phycocyanin from the cyanobacterium Spirulina maxima[J]. Journal of Applied Phycology, 1989, 1(1): 325-331.

[24] SONΙ B, KALAVADΙA B, TRΙVEDΙ U, et al. Extraction, purification and characterization of phycocyanin form Oscillatoria quadripunctulata: isolate form the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, Ιndia[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(9): 2017-2023.

[25] 丙瀟瀟. 藻膽蛋白的雙水相綠色提取技術研究[D]. 哈爾濱: 哈爾濱工業大學, 2009.

[26] 韓士群, 李輝東, 嚴少華, 等. 太湖藍藻藻藍蛋白的提取及純化[J].江蘇農業學報, 2012, 28(4): 777-782.

Extraction and Purifi cation of Phycocyanin by the Combined Use of Two-Step Salt Precipitation and Aqueous Two-Phase Extraction from Blue Algae

ZHANG Fayu, ZHAO Bingbing, CHEN Yu, YUAN Mengyuan, WANG Jiaquan*
(School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The crude extracts of phycocyanin from fres h blue algal were obtained by freeze-thaw method. The purifi cation of phycocyanin was performed by the combined use of two-step salting-out precipitation and aqueous two-phase extraction. The effect of different saturation degrees of (NH4)2SO4in two-step salt precipitation on purifi cation effi ciency was investigated using the 0.618 method, and the aqueous two-phase system of polyethylene glycol (PEG)-(NH4)2SO4was established after comprehensively considering the effect of PEG molecular weight, PEG mass fraction, (NH4)2SO4mass fraction, pH and phycocyanin mass concentration on purifi cation effi ciency. The results showed that the optimum (NH4)2SO4saturation was 21% in the fi rst step and 30% in the second step salt precipitation at 25 ℃. Using the aqueous two-phase system containing 10% PEG 1 000 and 25% (NH4)2SO4, the purity of purifi ed phycocyanin was 3.45.

two-step salting-out precipitation; aqueous two-phase extraction; extraction and purifi cation; phycocyanin

TQ464.7

A

1002-6630（2015）22-0006-05

10.7506/spkx1002-6630-201522002

2015-03-15

“十二五”國家科技重大專項（2012ZX07103-004）

張發宇（1983—），男，講師，博士研究生，研究方向為水處理技術。E-mail：13655551436@139.com

*通信作者：汪家權（1957—），男，教授，博士，研究方向為水處理技術。E-mail：jiaquan.wang@163.com