桑黃菌絲體黃酮液體發酵培養基的優化

許 謙

（菏澤學院生命科學系，山東 菏澤 274015）

桑黃是一種珍稀藥用真菌，屬于多層孔菌科，針層孔菌屬，具有抗菌、抗癌、抗氧化等藥用功效［1］。民間用以治療淋病、崩漏帶下、癥瘕積聚、癖飲及脾虛泄瀉等［2，3］。桑黃含有多糖、黃酮、三萜等多種活性成分［4，5］，其黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗衰老等功能［6，7］。對桑黃黃酮的研究以往大部分集中在子實體黃酮的提取和分離［8－10］，對液體培養生產桑黃菌絲體黃酮的研究報道較少［11，12］。自然條件下桑黃子實體的獲得需要幾十年的時間，而適宜條件下液體培養桑黃菌絲體只需十幾天時間。雷萍等［13］研究表明，桑黃菌絲體黃酮含量比子實體還要高。所以利用液體培養基，可以高效生產桑黃菌絲體黃酮［14］。

天然黃酮化合物泛指兩個具有酚羥基的苯環通過中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮，結構中常連有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團，常與糖類結合成苷，且因糖的種類、數量、聯接位置及方式不同組成各種類型。本研究在前期單因素試驗過程中，考慮到黃酮組成成分的多樣性，及桑黃菌絲體生長對營養物質的需求，利用營養豐富、成本較低的基質做單因素試驗，確定了單因素試驗最佳參數。本研究擬在此基礎上對生產菌絲體黃酮的液體培養基進行正交試驗優化，以克服前人［12］研究中成本較高、黃酮產量較低的問題，為桑黃黃酮工業化生產提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

桑黃（PH001）：由華中農業大學提供；

馬鈴薯、麩皮、玉米粉：山東菏澤牡丹區生產；

KH2PO4、葡萄糖：AR級，西隴化工股份有限公司；

MgSO4：AR級，天津凱通化學試劑有限公司；

AlCl3：AR級，天津市河東區紅巖試劑廠；

無水乙醇：AR級，濟南試劑總廠；

瓊脂：BR級，天津科密歐化學試劑有限公司；

蛋白胨：BR級，北京奧博興生物技術有限公司；

蘆丁對照品：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

高壓蒸汽滅菌鍋：MLS-3780型，Tega SANYO Industry Co.，Ltd；

雙層全溫振蕩器：HZQ-Y型，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；

電熱鼓風干燥箱：101-2型，北京市永光明醫療儀器廠；

電熱恒溫水浴鍋：SY2-4型，北京市醫療設備廠；

可見分光光度計：723N型，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

（1）PDA培養基：去皮馬鈴薯200g，切成小塊加蒸餾水1 000mL煮沸30min，4層紗布過濾，濾液中加葡萄糖20g和瓊脂20g，溶化后用蒸餾水補足至1 000mL，pH自然。121℃滅菌30min，倒平板。

（2）菌種活化：用打孔器（d＝1cm）取長滿菌絲的菌餅，每個平板接一個菌餅，28℃恒溫箱內培養15d。

1.2.2 液體培養

（1）液體培養基配制方法：玉米粉和麩皮加適量蒸餾水煮沸30min，4層紗布過濾，加蛋白胨、KH2PO4和 MgSO4溶解后，定容，pH自然，分裝于250mL三角燒瓶中，每瓶150 mL，8層紗布封口，121℃滅菌30min。

接種量為每瓶2塊菌餅（d＝1cm），培養溫度28℃，搖床轉速160r/min，液體培養時間18d。每種培養基3個重復。

（2）液體培養基優化試驗設計：根據前期預試驗結果，進行正交試驗，正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.2.3 AlCl3比色法（427nm）標準曲線繪制 參照文獻［14］。準確稱量26mg蘆丁置于100mL容量瓶中，用60%乙醇溶解至刻度，分別移取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL于10mL容量瓶中，分別添加1%AlCl3稀釋至刻度，搖勻靜置10min，在427nm處測定吸光度，以蘆丁質量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線（見圖1）。

1.2.4 菌絲體的黃酮產量測定 4層紗布過濾培養液，蒸餾水洗3遍，得菌絲球，烘干至恒重，稱重。

準確稱取桑黃菌絲體（粉碎后過60目篩）0.5g，加60%乙醇15mL于70℃提取2h，流水冷卻，定容至25mL，過濾。取濾液5mL于10mL容量瓶中，添加1%AlCl3稀釋至刻度，搖勻靜置10min，在427nm處測定吸光度（做3個重復）。據回歸方程算出黃酮含量。并按式（1）計算黃酮產量。

圖1 AlCl3比色法（427nm）標準曲線Figure 1 AlCl3colorimetry（427nm）standard curve

式中：

Y——黃酮產量，mg/L；

C——黃酮含量，mg/g；

B——菌絲體生物量，mg/L。

2 結果與分析

2.1 正交試驗計算結果

由表2可知，對菌絲體生物量的影響，4種因素影響水平由高到低依次為D＞C＞A＞B，菌絲體生物量最高的為配方6（A2B3C1D2），最低的為配方5（A2B2C3D1），最優配方為 A3B3C2D2；對黃酮產量的影響，4種因素影響水平由高到低依次為C＞D＞B＞A，黃酮產量最高的為配方2（A1B2C2D2），最低的為配方1（A1B1C1D1），最優配方為A3B3C2D2。

2.2 培養基配方各因素對黃酮產量及菌絲體生物量的影響

由表3可知，液體培養基配方4個因素中，B、C、D三因素對黃酮產量都有極顯著影響，因素A對黃酮產量的影響不顯著。

培養基配方各因素對黃酮產量影響的方差分析結果說明，因素A（碳源）盡管保證了菌絲體合成黃酮時對各種糖的需求，但對黃酮的產生并沒有造成顯著影響，其他因素B、C和D（蛋白胨，KH2PO4和MgSO4）對菌絲體黃酮產量均具有極顯著的影響，所以，黃酮產量主要是由培養基中的蛋白胨、KH2PO4、MgSO4決定。造成這種結果原因有三：① 蛋白胨為菌體生長提供充足的氮素營養，保證了代謝物黃酮的產生；②KH2PO4為菌體遺傳物質的合成提供磷元素并且為協調菌體的正常生理功能提供鉀元素；③ MgSO4促進了與黃酮合成有關酶的產生。

由表4可知，液體培養基配方4個因素中，A、C、D三因素對菌絲體生物量都有極顯著影響。B因素對菌絲體生物量有顯著影響。

培養基配方各因素對菌絲體生物量影響的方差分析結果說明，菌絲體生物量主要由培養基中的因素A、C和D（碳源、KH2PO4、MgSO4）決定，因素B（蛋白胨）對菌絲體的合成也起到顯著的作用。

表2 L9（34）正交試驗計算結果Table 2 Calculation results of L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗計算結果Table 2 Calculation results of L9（34）orthogonal test

菌絲體生物量及黃酮產量都是3個重復所得數據的平均值。

配方 A碳源 B蛋白胨 C KH2PO4D MgSO4菌絲體生物量/（mg·L－1）黃酮產量/（mg·L－1）1 1 1 1 1 11 836.00 66.50 2 1 2 2 2 18 812.33 201.23 3 1 3 3 3 16 029.33 170.11 4 2 1 2 3 22 415.11 190.38 5 2 2 3 1 11 281.33 68.96 6 2 3 1 2 22 503.00 154.37 7 3 1 3 2 20 225.67 145.92 8 3 2 1 3 18 897.55 130.34 9 3 3 2 1 18 702.89 195.23 菌絲體生物量k115 559.22 18 158.93 17 745.52 13 940.07 k218 733.15 16 330.41 19 976.78 20 513.67 k319 275.37 19 078.41 15 845.44 19 114.00 R 3 716.15 2 748.00 4 131.33 6 573.59黃酮產量k1 145.95 134.27 117.07 110.23 k2 137.90 133.51 195.61 167.17 k3 157.16 173.23 128.33 163.61 R 19.26 39.72 78.54 56.94

表3 培養基配方各因素對黃酮產量影響的方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonality of medium formula factors＇influence on flavone yield

表3 培養基配方各因素對黃酮產量影響的方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonality of medium formula factors＇influence on flavone yield

F0.05（2，18）＝ 3.54，F0.01（2，18）＝ 6.01。

差異源 平方和 自由度 均方和 F值 顯著性157.176 8 18 8.732 043 A 39.223 39 2 19.611 7 2.245 946 B 206.557 9 2 103.279 11.827 58 ＊＊C 722.943 1 2 361.471 5 41.395 99 ＊＊D 406.108 5 2 203.054 3 23.253 92 ＊＊誤差

表4 培養基配方各因素對菌絲體生物量影響的方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonality of medium formula’s influence on mycelium biomass

2.3 驗證實驗

由表5可知，利用最優配方（A3B3C2D2）、菌絲體生物量最高配方（A2B3C1D2）和黃酮產量最高配方（A1B2C2D2）進行液體培養后，最優配方獲得的菌絲體生物量和黃酮產量最高，對三者進行方差分析，3種配方對菌絲體生物量和黃酮產量的影響差距顯著。綜合兩項指標，A3B3C2D2為最優配方，即：玉米粉3% ＋麩皮7%，蛋白胨2.0%，KH2PO40.10%，MgSO40.15%。用這個配方進行桑黃生產，可以同時獲得菌絲體生物量高產及黃酮高產。

表5 驗證實驗結果Table 5 Results of the verification test（n＝3）（mg·L－1）

本試驗菌絲體黃酮產量為212.35mg/L，遠遠高于趙子高等［11］試驗所得（12.805 6mg/100mL）及劉凡等［12］試驗所得（186.75mg/L）。造成這種差距可能有以下幾個原因：①培養基成分差異造成了菌絲體黃酮產量的較高差異，其中文獻［11］和［12］中沒有用到的蛋白胨成分是主要原因，另外本試驗中麥麩的添加也是一個不可忽視的因素；② 較高轉速有利于好氧型桑黃菌絲體的生長及菌絲體黃酮的生產，文獻［11］和［12］中液體培養桑黃所用轉速為150r/min，本試驗所用搖床轉速為160r/min；③ 較大的培養基裝入量適宜于菌種活性的長時間維持，為提高菌絲體產量和黃酮產量提供了物質基礎，提高了生產效率，文獻［11］和［12］中液體培養桑黃所用培養基裝入量為容器的2/5，本試驗所用的液體培養基裝入量為容器的3/5。

3 結論

本試驗在前期單因素試驗的基礎上，利用正交設計確定液體培養基配方，研究各配方對菌絲體生物量及黃酮產量的影響，最終通過驗證實驗確定了優化的液體培養基配方為A3B3C2D2（玉米粉3% ＋ 麥麩7%，蛋白胨2.0%，KH2PO40.10%，MgSO40.15%），菌絲體黃酮產量為212.35mg/L，遠遠高于趙子高［11］、劉凡［12］等的試驗結果。而且本試驗直接將平板活化的菌種定量接種在液體培養基里進行正交分析試驗，較文獻［11］和［12］增加了試驗定量的準確性，并簡化了一次接種工作。

本試驗結果表明，利用液體培養技術能夠在較短時間內生產大量桑黃菌絲體及菌絲體黃酮，不受季節和環境的限制，可以大幅度降低桑黃黃酮作為新藥開發的成本。試驗所確定的優化液體培養基將對工業化生產桑黃菌絲體黃酮具有一定的指導意義，應用前景廣闊。

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