復合蛋白酶水解玉米谷蛋白產物的抗氧化活性研究

劉 玥 劉曉蘭 鄭喜群 周利敏

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

在玉米濕法淀粉加工過程中，可從淀粉乳中分離出5%～6%的玉米蛋白粉，玉米蛋白粉含蛋白質60%以上，玉米谷蛋白占其總蛋白含量的22%。玉米谷蛋白含大量酰胺基氨基酸，其中谷氨酰胺占總氨基酸的1/3［1］。谷氨酰胺是細胞增殖的主要能源，是增強腸免疫的重要營養物質；又是合成體內極其重要的抗氧化劑—還原型谷胱甘肽的前體物質［2］。玉米谷蛋白由于富含二硫鍵而不溶于水，可溶于稀酸或稀堿溶液［3］，此特點限制了其功能性質的發揮和應用。

生物體中活性自由基的積累會產生諸多破壞作用，如損傷細胞膜、使血清蛋白酶失去活性、損傷基因導致細胞變異、對機體造成衰老或引發其他疾病［4］。在食品加工及貯藏中，自由基會引起食品發生脂質過氧化，從而引起食品的變質。人工抗氧化劑可能存在潛在的健康風險，因此需迫切開發天然抗氧化劑。Suetsuna K、Pena-Ramos EA、王俊彤等［5－7］已分別在酪蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白中發現了許多抗氧化活性肽。目前未見復合蛋白酶（protamex）水解玉米谷蛋白酶解物抗氧化活性研究的相關報道。本研究擬采用Protamex水解玉米谷蛋白，探索水解時間對蛋白酶解物抗氧化活性的影響，以期為玉米谷蛋白在功能食品中的應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

玉米蛋白粉：黑龍江龍鳳玉米開發有限公司；

Protamex復合蛋白酶：4.32×104U/g，諾維信公司；

其他試劑：分析純；

pH計：PB-10型，北京伯樂生命科學發展有限公司；

雙光束紫外可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責任公司；

可見分光光度計：722s型，上海欣茂儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米谷蛋白酶解物的制備 將玉米谷蛋白按底物濃度5% （m/V）加入到磷酸鹽緩沖液（pH 7.0，50mmol/L）中，50℃下按酶與底物之比為0.81∶100（m∶m）加入復合蛋白酶Protamex，向反應體系中滴加0.2mol/L NaOH溶液維持pH 恒定，控制水解時間分別為15，30，60，90，120，150 min。酶解反應后于沸水中滅酶30min，10 000r/min離心15min得酶解液，酶解液冷凍干燥待用。

1.2.2 玉米谷蛋白酶解物的水解度測定 采用pH-stat法［8］。

1.2.3 玉米谷蛋白酶解物分子量分布測定 凝膠柱Superdex Peptide 10/300GL安裝于purifier100蛋白質色譜儀上，上樣量100μL，流速0.25mL/min，檢測波長214nm，流動相為 含 0.15mol/L NaCl的 磷 酸 鹽 緩 沖 液 （pH 7.0，0.02mol/L），上樣前標準蛋白于10 000r/min離心10min，并用0.22μm微孔濾膜過濾。測定藍色葡聚糖2000和各分子量標準蛋白（Aprotinine、桿菌肽、氧化型谷光甘肽、還原型谷光甘肽）的洗脫體積（Ve）。根據標準蛋白的凝膠過濾洗脫曲線，做標準蛋白分子量對數（lgMr）與可用分配系數（Kaw）關系的標準曲線，其中Kaw＝（Ve－V0）/（Vt－V0）。由于藍色葡聚糖2000在Superdex Peptide 10/300GL色譜柱上被完全排阻，其洗脫體積Ve相當于色譜柱外水體積V0，柱床總體積Vt為24mL。根據各分子量標準的洗脫體積，計算相應Kaw，做標準蛋白分子量對數（lgMr）與可用分配系數（Kaw）關系的回歸方程。

玉米谷蛋白酶解物（2mg/mL）用流動相溶解，10 000r/min離心10min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，上樣量100μL，流動相進行洗脫，流速0.25mL/min，檢測波長214nm。根據玉米谷蛋白酶解物凝膠過濾洗脫體積，計算相應Kaw，根據標準蛋白分子量對數（lgMr）與可用分配系數（Kaw）關系的回歸方程，計算玉米谷蛋白酶解物的分子量。

1.2.4 玉米谷蛋白酶解物抗氧化活性測定

（1）清除DPPH自由基活性的測定：根據文獻［9］，修改如下：取2mL玉米谷蛋白酶解液（2mg/mL），加入2mL DPPH無水乙醇溶液（0.1mmol/L），混合均勻，避光反應30 min，在517nm處測其吸光值（Ai）；取2mL玉米谷蛋白酶解液于試管中，加入2mL無水乙醇，在517nm處測其吸光值（Aj）；取2mL DPPH 無水乙醇溶液（0.1mmol/L）和2mL無水乙醇反應作為參比，在517nm處測其吸光值（A0）。0.01mg/mL的VC溶液作為對照。樣品對DPPH自由基的清除率K按式（1）計算：

式中：

K——對DPPH自由基的清除率，%；

A0——2mL DPPH 無水乙醇溶液（0.1mmol/L）與2 mL無水乙醇在517nm下的吸光值；

Ai——2mL DPPH 無水乙醇溶液（0.1mmol/L）與2 mL樣品溶液反應在517nm下的吸光值；

Aj——2mL無水乙醇與2mL樣品溶液在517nm下的吸光值。

（2）清除羥基自由基（·OH）活性的測定：根據文獻［10］，修改如下：取2mL玉米谷蛋白酶解液（2mg/mL），依次加入2mL FeSO4（6mmol/L）、H2O2（6mmol/L），混勻后靜置10min，再加入2mL水楊酸 （6mmol/L），混勻，靜置30min，在510nm處測定吸光值（Ai＇）。用去離子水代替水楊酸重復以上操作測定510nm處的吸光值（Aj＇），用去離子水代替樣品重復以上操作測定510nm處的吸光值（A0＇）。0.01mg/mL的VC溶液作為對照。樣品對羥基自由基的清除率Y按式（2）計算：

式中：

Y——對羥基自由基的清除率，%；

Ai＇——樣品溶液在510nm處的吸光值；

A0＇——去離子水代替樣品在510nm處的吸光值；

Aj＇——去離子水代替水楊酸在510nm處的吸光值。

式中：

I——對超氧陰離子自由基的抑制率，%；

V空白——空白組鄰苯三酚自氧化速率，A/min；

V樣品——樣品組鄰苯三酚自氧化速率，A/min。

（4）還原力測定：根據文獻［12］，修改如下：取2mL玉米谷蛋白酶解液（2mg/mL），分別加入2mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6，0.2mol/L），2mL質量分數為1%的鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）溶液，混勻，在50℃水浴下保溫20min，再加入2 mL質量分數10%的三氯乙酸（TCA）溶液，震蕩搖勻后以4 000r/min離心10min。取離心后上清液2mL，加入2mL去離子水和0.4mL質量分數為0.1%的FeCl3溶液，震蕩搖勻后在50℃水浴下保溫10min，在700nm波長下測定溶液的吸光值。以去離子水代替樣品重復以上操作作為空白，0.01 mg/mL的VC溶液作為對照。

（5）與亞鐵離子螯合能力的測定：根據文獻［13］，修改如下：取1mL玉米谷蛋白酶解（2mg/mL）液加入2mL FeCl2（20μmol/L），混 勻 后 加 入 2mL 菲 洛 嗪 溶 液 （0.5mmol/L），劇烈震蕩搖勻，室溫下靜置10min，在563nm處測定吸光值（A樣品），以去離子水代替玉米谷蛋白酶解液作為空白（A空白）。0.01mg/mL的 VC溶液作為對照。樣品與亞鐵離子的螯合率按式（4）計算：

式中：

Y——與亞鐵離子的螯合率，%；

A樣品——樣品溶液參加以上反應測定563nm處的吸光值；

A空白——去離子水參加以上反應測定563nm處的吸光值。

1.3 數據分析

試驗中數據都是3次測定的平均值，以平均值±標準差表示，采用IBM SPSS Statistics 19軟件中的單因素方差分析（One-way AVONA）和Duncan多重比較法進行數據統計學分析，P＜0.05為差異顯著，用Excel 2003軟件繪制圖示。

2 結果和討論

2.1 水解時間的影響

由表1可知，Protamex水解玉米谷蛋白反應時間在15～150min內，水解度變化緩慢，但酶解物的分子量分布變化較大。水解時間為15min時，酶解物中分子量大于6 511Da的蛋白組分占82.39%；水解時間為120min時，酶解物中分子量6 511.51～307.32Da的組分占94.36%。即隨著水解時間的延長，大分子量蛋白含量逐漸降低，小分子量蛋白含量逐漸增加。

表1 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時間與其水解度和分子量分布關系Table 1 Hydrolysis degree and molecular weight distribution of corn glutelin hydrolysate by Protamex during hydrolysis process

2.2 清除DPPH自由基的活性

由圖1可知，Protamex酶解玉米谷蛋白時，不同水解時間的酶解物對DPPH自由基都具有清除作用，但清除能力有差異，顯著性分析結果表明水解時間在15～90min范圍內的差異不大。水解時間為120min時，酶解物對DPPH自由基的清除率達到最大值，為（58.86±1.40）%，該值與0.01mg/mL的Vc溶液對DPPH自由基的清除率相當，且顯著性分析結果表明該值與Vc溶液對DPPH自由基的清除率之間無顯著性差異。這個結果表明，玉米谷蛋白酶解物中大分子量和小分子量肽段均具有對DPPH自由基的清除活性，水解時間為120min時，酶解物中的大分子量和小分子量的肽段均達到對DPPH自由基清除率的最大值，酶解過程中可能產生具有供氫能力的氨基酸如色氨酸和酪氨酸。在水解時間為150min時，酶解物對DPPH的清除率反而降低，可能原因是酶解產物由于過度水解，大分子量的肽段繼續水解成小分子的肽段，從而使對DPPH自由基具有清除能力的肽段被破壞，具有活性的氨基酸含量降低。酶解物的分子量和水解時間與對DPPH自由基的清除率高低不具有相關性［14］，過度水解其對DPPH自由基清除能力反而下降。

圖1 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時間與酶解物對DPPH自由基清除率的關系Figure 1 Relation between hydrolysis time and DPPH radical scavenging activities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

2.3 清除羥基自由基的活性

圖2 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時間與酶解物清除羥基自由基活性的關系Figure 2 Relation between hydrolysis time and hydroxyl radical scavenging activities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

由圖2可知，Protamex酶解玉米谷蛋白時，不同水解時間的酶解物對羥基自由基都有很強的清除率。水解時間為15min時，酶解物已經顯示出對羥基自由基的清除能力，此時清除率達到（82.89±1.53）%；水解時間在30～60min內酶解物對羥基自由基清除率變化不大，水解時間為120min時，酶解物對羥基自由基的清除率達到（82.64±0.75）%，而作為對照的Vc溶液對羥基的清除率為（34.09±1.33）%。結果表明，低濃度的酶解物在水解反應初期（水解時間為15 min時）具有很好的對羥基自由基的清除效果，可能原因是酶解反應過程中，玉米谷蛋白致密的結構被破壞，具有抗氧化活性的基團部分暴露出來，其中分子量大于6 511.51Da的肽段清除羥基自由基活性為主要作用，該水解度下生成具有清除羥基自由基的重要肽段。隨著水解時間延長，水解時間在90和120min時，分子量在6 511.51～307.32Da的肽段清除羥基自由基活性為主要作用。水解時間為150min時，分子量在6 511.51～307.32Da的肽段被水解成更小的肽段，破壞了具有清除能力的肽段，使其清除羥基自由基活性下降。顯著性分析結果表明水解時間為15，90，120min的酶解樣品之間無顯著性差異，酶解物的分子量和水解時間與其清除羥基自由基能力不存在相關性，與其具有活性的肽段有關。

2.4 清除超氧陰離子（·）的活性

2.5 玉米谷蛋白酶解物的還原力

由圖4可知，Protamex酶解玉米谷蛋白時，各水解時間的酶解物均有較高的還原力。水解時間為90，120min時，酶解物的還原力較高分別為0.234±0.003和0.236±0.004，該值和0.01mg/mL的Vc溶液相當。顯著性分析結果表明各水解時間的酶解物還原力相差不大，均有良好的抗氧化能力，與水解時間和水解度沒有一定的相關性，可能原因是酶解過程中Protamex的作用位點廣泛，專一性不強，酶解物中所含抗氧化肽結構、氨基酸組成及序列差異不大。

圖3 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時間與酶解物對超氧陰離子抑制活性的關系Figure 3 Relation between hydrolysis time and superoxide anion scavenging activities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

圖4 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時間與酶解物還原力的關系Figure 4 Relation between hydrolysis time and reducing powers of corn glutelin hydrolysate by Protamex

2.6 玉米谷蛋白酶解物與亞鐵離子螯合的能力

由圖5可知，Protamex水解玉米谷蛋白時，各水解時間的酶解物與亞鐵離子均有一定的螯合能力。水解時間為15 min時，酶解物即具有與亞鐵離子的螯合能力，肽鍵斷裂，暴露出具有活性的氨基酸，如組氨酸是常見的具有與金屬螯合能力的氨基酸。延長水解時間對亞鐵離子螯合能力提高顯著，酶解時間120min時，酶解物與亞鐵離子螯合能力達到最高值為（29.92±2.96）%，而Vc溶液對亞鐵離子幾乎沒有螯合作用，這與楊雙等［15］的報道一致。玉米谷蛋白酶解物與亞鐵離子的螯合能力雖然不高，但是可以在一定程度上減緩蛋白質被氧化，是非常重要的天然抗氧化劑。

圖5 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時間與酶解物與亞鐵離子的螯合能力的關系Figure 5 Relation between hydrolysis time and Fe2＋-chelating abilities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

3 結論

研究結果表明，Protamex水解玉米谷蛋白時，各水解時間下酶解物都具有抗氧化活性，抗氧化能力都有差異。酶解物的抗氧化活性與水解時間和水解度沒有相關性，酶解物中大分子肽段和小分子肽段均具有一定的抗氧化活性。Protamex酶解時間為120min時的酶解物具有較高的抗氧化活性，可能與其活性肽段有關，因此通過控制Protamex水解玉米谷蛋白的時間可以得到具有高抗氧化活性的酶解物，將對玉米谷蛋白的應用奠定良好的基礎。其中Protamex水解玉米谷蛋白的水解度和分子量分布與其抗氧化活性的關系需要進一步的試驗。

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