QuEChERS—UPLC—MS/MS法同時測定羊奶中8種β－內酰胺類抗生素

王帥帥鄭小平孟 瑾何亞斌

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海必諾檢測技術服務有限公司，上海 200436）

羊奶營養豐富、易于吸收，其蛋白質和脂肪含量均高于牛奶，被國際營養學界稱為“奶中之王”［1］。在中國奶類產量中，山羊奶是第二大奶類，中國已成為飼養奶山羊最多的國家［2］。β－內酰胺類抗生素可以治療奶羊乳腺炎、心包炎等疾病，在奶羊養殖過程中，由于缺乏科學用藥的知識，或受經濟利益的驅使，不合理用藥現象仍很嚴重［3］。長期食用含有β－內酰胺類抗生素的羊乳會引起疾病，如過敏反應、致畸反應以及增加細菌的耐藥性［4］。

目前，國內外關于羊奶中β－內酰胺類抗生素的檢測報道較少［5］，牛奶中β－內酰胺類抗生素的測定多采用傳統的固相萃取法（SPE）凈化樣品［6－9］，與傳統的固相萃取凈化法相比，QuEChERS凈化法具有樣品前處理時間短、節省溶劑、降低檢測成本等優點。本研究擬在參考牛奶中β－內酰胺類抗生素檢測 方 法［10－13］的 基 礎 上，用 改進 的 QuEChERS 凈 化法［14］，結合超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC—MS/MS）測定羊奶中8種β－內酰胺類抗生素。試驗以乙腈為提取試劑，C18和PSA吸附劑凈化處理，具體考察提取試劑、吸附劑類別和用量等條件對回收率的影響。以期為羊奶中β－內酰胺類抗生素的檢測提供一種快速、可靠的檢測方法，同時對相關標準的制定亦具有指導意義。羊奶中蛋白質和脂肪的含量與牛奶中相差不大，本方法也適用于牛奶中β－內酰胺類抗生素的測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜—串聯質譜儀：Waters XEVO TQ型，ESI源，美國沃特世公司；

高速冷凍離心機：Heraeus Multifuge X1R型，美國熱電公司；

氮吹儀：ANPEL DC12型，上海安譜科學儀器有限公司；

超聲波儀：TH型，上海安譜科學儀器有限公司。

乙腈：色譜純，德國Merck公司；

甲酸：分析純，美國Sigma公司；

C18粉、PSA吸附劑：天津博納艾杰爾科技有限公司；

標準品：阿莫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、氨芐西林、頭孢噻呋、青霉素G、苯唑西林、氯唑西林，純度＞98.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

羊奶：市售。

1.2 標準溶液配制

（1）標準儲備溶液：分別準確稱取8種標準品各10mg，用50%乙腈水溶液溶解并定容至10mL，即得1.0mg/mL的標準儲備液，低溫儲存備用。

（2）混合標準儲備液：吸取8種標準儲備液各100μL，用50%乙腈水溶液溶解并定容至10mL，即得10μg/mL的混合標準儲備液。

（3）標準工作溶液：用50%乙腈水溶液逐級稀釋混合標準儲備液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取 稱取5.00g羊奶于50mL離心管中，加入乙腈10mL，渦旋振蕩1min，超聲提取10min，8 000r/min離心5min，上清液待凈化。

1.3.2 凈化 取1.3.1中上清液8mL轉移至15mL離心管中（管中預先加入150mg C18和150mg PSA），渦旋混勻1 min，5 000r/min離心3min，取6mL上清液氮氣吹干，殘渣用1mL 10%乙腈水溶液復溶，過0.22μm有機相濾膜，上機分析。

1.4 分析條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTM C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；柱溫30℃；流動相梯度洗脫程序：0～1min，95%A，1～4min，95%～50%A，4～6min，50%A，6～7min，50%～95%A，7～8min，95%A，進樣量：5 μL，流速：0.3mL/min。

1.4.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；毛細管電壓：1.60kV；離子源溫度：150℃；去溶劑溫度：500℃；去溶劑氣流：氮氣，800L/h；碰撞氣：氬氣；多反映監測模式（MRM）采集。8種β－內酰胺類抗生素的保留時間、母離子、子離子以及對應的碰撞能量見表1。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

測定牛奶中β－內酰胺類抗生素時通常使用甲醇/0.1%甲酸水溶液或乙腈/0.1%甲酸水溶液作流動相，本試驗比較了這兩種流動相對8種β－內酰胺類抗生素色譜行為的影響。結果表明，以甲醇/0.1%甲酸水溶液為流動相時，5種青霉素類化合物響應值較低，峰形較差，以乙腈/0.1%甲酸—水溶液為流動相時，8種目標化合物分離完全，且峰形較好，故選用乙腈/0.1%甲酸水溶液為流動相，8種β－內酰胺類抗生素的總離子流圖見圖1。

表1 8種β－內酰胺類抗生素質譜條件Table 1 MS parameters of 8β-lactams

圖1 8種β－內酰胺類抗生素總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram （TIC）of 8β-lactams

2.2 樣品處理條件的選擇與優化

2.2.1 提取試劑的選擇 試驗比較了甲醇、乙腈、1%甲酸乙腈3種提取試劑對待測組分回收率的影響，結果見圖2。由圖2可知，乙腈去蛋白的能力較強，提取效果最好，甲醇中的羥基會加速青霉素的分解，酸性條件下，頭孢類抗生素的提取效果比青霉素類抗生素好，綜合考慮，選擇乙腈作為提取試劑。

2.2.2 吸附劑對凈化效果的影響 試驗比較了C18、PSA和C18＋PSA（1＋1）3種凈化方式對回收率的影響，結果見圖3。由圖3可知，C18＋PSA（1＋1）混合使用比單獨使用凈化效果好，這是由于C18主要吸附樣品中的脂肪和蛋白，PSA主要吸附樣品中的脂肪酸和糖類雜質，單獨使用C18或PSA時，樣品中脂肪和蛋白吸附不完全，存在較大的基質效應，綜合考慮，選擇C18＋PSA凈化方式凈化樣品。

2.2.3 C18＋PSA（1＋1）吸附劑用量對凈化效果的影響 試驗優化了C18＋PSA（1＋1）吸附方式的不同用量對8種β－內酰胺類抗生素的凈化效果，結果見圖4。由圖4可知，當C18＋PSA吸附劑為300mg時，各組分的回收率最高。吸附劑用量為100mg時，樣品中蛋白和脂肪吸附不完全，吸附劑用量為500mg時，吸附劑會吸附樣品中目標化合物，導致回收率降低，綜合考慮，選擇吸附劑用量為300mg。

圖2 提取試劑對提取效果的影響Figure 2 Effect of extraction reagent on extraction efficiency

圖3 吸附劑對凈化效果的影響Figure 3 Effect of different sorbents on extraction efficiency

圖4 C18＋PSA用量對凈化效果的影響Figure 4 Effect of weight of C18and PSA on extraction efficiency

2.3 線性范圍和方法檢出限

用空白樣品提取液配制系列標準曲線，標準曲線濃度分別為1.0，5.0，10.0，25.0，50.0μg/kg。按1.3的方法處理測定，測定后以各組分的峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X，μg/kg）為橫坐標，繪制標準曲線，以信噪比S/N≥3確定方法的檢出限（LOD），以信噪比S/N≥10確定方法的定量限（LOQ），8種β－內酰胺類抗生素的方法檢出限為0.25～1.00μg/kg，定量限為1.0～2.0μg/kg。在1.0～50.0μg/kg濃度范圍內，8種目標化合物的線性方程、相關系數、方法檢出限和定量限見表2。

表2 各化合物的線性方程及方法檢出限Table 2 Linear equations and correlation coefficients

2.4 方法回收率和精密度

用同一空白羊奶樣品做加標回收試驗，8種β－內酰胺類抗生素的添加水平分別設定為5.0，10.0，25.0μg/kg。按照1.3的方法進行測定，每個添加水平做6個平行樣，結果見表3。

表3 8種β－內酰胺類抗生素的回收率和精密度Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of 8β-lactams in spiked milk samples（n＝6）

2.5 實際樣品的測定

應用本方法對15份市售的羊奶進行檢測，按1.3中樣品處理方法操作，各樣品中均未檢測到8種β－內酰胺類抗生素的殘留，說明測定的15份羊奶質量較好。

3 結語

本試驗建立了QuEChERS凈化法結合超高效液相色譜串聯質譜法測定羊奶中8種β－內酰胺類抗生素的方法，該方法使用吸附劑直接凈化樣品，與傳統固相萃取凈化相比，該方法樣品前處理簡單快速、提高了檢測效率，同時也具有較好的回收率和較低的檢出限，方法實用性較強，為羊奶及其他奶制品中β－內酰胺類抗生素的殘留檢測提供了可靠的方法，對相關標準的制定也具有指導性意義。

1 王逸斌，徐莎，侯艷梅，等.山羊奶的營養成分研究進展［J］.中國食物與營養，2012，18（10）：67～71.

2 任洪輝，張鵬，王永.我國奶羊產業發展的前景問題和對策［J］.江蘇農業科學，2013，41（11）：230～232.

3 趙善倉，李增梅，董燕婕，等.我國奶羊產業發展與羊乳質量安全現狀及對策研究［J］.農產品質量與安全刊，2014（6）：12～14.

4 Kantiani Lina，FarréMarinella，BarcelóDamiá，et al.Analytical methodologies for the detection ofβ-lactam antibiotics in milk and feed samples［J］.Journal of TrAC Trends in Analytical Chemistry，2009，28（6）：729～744.

5 Camara M，Gallego A，Garcinuno R M，et al.An HPLC—DAD method for the simultaneous determination of nineβ-lactam antibiotics in ewe milk［J］.Journal of Food Chemistry，2013（141）：829～834.

6 Kukusamude Chunyapuk，Burakham Rodjana，Chailapakul Orawon，et al.High performance liquid chromato-graphy for the simultaneous analysis of penicillin residues in beef and milk using ion-paired extraction and binary water-acetonitrile mixture ［J］.Talanta，2012，92：38～44.

7 Li Na-si，Feng Feng，Yang Bing-cheng，et al.Simultaneous determination of beta-lactam antibiotics and beta-lactamase inhibitors in bovine milk by ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry ［J］.Journal of Chromatography B，2014，110（4）：945～946.

8 劉洪斌，文一，劉勇軍，等.LC—MS/MS法檢測牛奶中14種β-內酰胺類抗生素殘留［J］.分析實驗室，2014，33（2）：221～224.

9 張秀堯，蔡欣欣.超高效液相色譜5三重四極桿質譜法快速同時測定牛奶中53種β－內酰胺類抗生素及其代謝產物的殘留［J］.色譜，2014，32（7）：693～701.

10 陳瑞春，賈海濤，艾連中，等.高效液相色譜—串聯質譜法測定牛奶和奶粉中9種青霉素類藥物殘留量［J］.食品科學，2011，32（18）：249～252.

11 黃百芬，吳丹青，蔡增軒，等.超高效液相色譜—串聯質譜法同時測定牛奶中19種β－內酰胺類抗生素［J］.中國衛生檢驗雜志，2010，20（1）：1～6.

12 Shiu-Hsieh Huan，His-Ya Huang，Szetsen Lee.Determination of eight penicillin antibiotics in pharmaceuticals，milk and porcine tissues by nano-liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2009，1 216（43）：7 186～7 194.

13 李欣楠，韓鐫竹，蘇葳藝.超高效液相色譜—串聯質譜法同時測定生鮮乳中7類β－內酰胺類抗生素殘留［J］.現代畜牧獸醫，2013（11）：40～45.

14 R Perez-Burgos，E M Grzelak，J Saurina，et al.Quechers methodologies as an alternative to solid phase extraction（SPE）for the determination and characterization of residues of cephalosporins in beef muscle using LC—MS/MS［J］.Journal of Chromatography B，2012（899）：57～65.