氣相色譜—質譜法測定食用檳榔中對羥基苯甲酸乙酯的測量不確定度評定

陳幸鶯

（湘潭市食品藥品檢驗所，湖南 湘潭 411100）

測量不確定度是根據所用到的信息，表征賦予被測量值分散性的非負參數［1］。一個完整的測量結果，除了應給出被測量的最佳估計值外，還應同時給出測定結果的不確定度。食用檳榔作為一種果實加工食品，因原產地和生產加工地域不同、防腐保質要求較高等特點，加工過程中對食品添加劑、防腐劑方面有較高的要求。湖南省地方標準DB 43/132—2004《食用檳榔》中規定，防腐劑脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯可用于食用檳榔加工。其中對羥基苯甲酸酯作為毒性較低的一種廣譜防腐劑，被包括美國、歐盟、中國在內的許多國家允許應用于食品。DB 43/132—2004中也規定，檳榔食品中對羥基苯甲酸酯添加量為0.5g/kg（以對羥基苯甲酸計）。但近年來有研究［2］報道對羥基苯甲酸酯類有潛在的雌激素活性，對人體健康安全有一定的影響，專家要求重新評定對羥基苯甲酸酯類物質的每日允許攝入量等安全性評價指標。本研究擬采用氣相色譜—質譜聯用法測定食用檳榔中對羥基苯甲酸乙酯含量，并依據JJF 1059.1－2012《測量不確定度評定與表示》的規定找出影響不確定度的各種因素，合成不確定度及擴展不確定度，為其測定方法的探討和檢測結果的評估提供依據。

1 試驗部分

1.1 原理

樣品酸化后，對羥基苯甲酸酯類用乙酸乙酯提取后，經氣相色譜進行分離，以特征離子峰進行定性定量。

1.2 儀器和試劑

氣相色譜—質譜聯用儀：7890A-5975C型，美國安捷倫科技有限公司；

電子天平：BS210S型，德國賽多利斯集團；

乙酸乙酯：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；

對羥基苯甲酸乙酯標準物質：GBW（E）100064，相對擴展不確定度0.2%，k＝2，國家標準物質研究中心。

1.3 測量條件

1.3.1 色譜條件 載氣：高純氦氣（99.999%）；色譜柱：DB-5MS毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；柱流速：1.0mL/min；分流比：10︰1；汽化室溫度：250℃；柱溫程序：初始溫度50℃，保持1min，以10℃/min速率升溫至200℃，保持3min。

1.3.2 質譜條件 傳輸線溫度：220℃；離子源溫度：250℃；離子化方式：EI；電子能量：70eV；延遲時間2.0min；檢測方式：全掃描；質量范圍：m/z25～300。

1.4 測量過程

稱取10g試樣（精確至0.000 1g），加1mL鹽酸（1＋1）（V/V）酸化，加10mL飽和氯化鈉溶液、準確加入10.00mL乙酸乙酯渦旋2min，超聲提取20min，棄去水層。加入10 mL碳酸氫鈉溶液（1g/100mL），渦旋2min，靜置10min，8 000r/min離心15min，取上清液過濾膜供質譜測定。

1.5 質譜圖

氣相色譜—質譜聯用法測得對羥基苯甲酸乙酯的質譜圖見圖1。

圖1 對羥基苯甲酸乙酯質譜圖Figure 1 P-hydroxy benzoic acid ethyl ester mass spectrogram

圖2 不確定度來源Figure 2 The sources of uncertainty

2 測量不確定度評定

由測量所得的測得值只是被測量的估計值，測量過程中的系統效應及隨機效應均會導致測量不確定度。對于檢測結果除了給出最優的估計值外，其相對不確定度評估也相當重要。本研究依據JJF 1059.1－2012《測量不確定度評定與表示》的方法，建立食用檳榔中對羥基苯甲酸酯類測定結果的數學模型，找尋不確定來源，并對不同類別的不確定度分量進行評定，合成不確定度及擴展不確定度。

2.1 測量數學模型

根據本研究的檢驗原理，評定對羥基苯甲酸乙酯測量結果不確定度的數學模型可以用式（1）表示：

式中：

X——被測食用檳榔樣品中對羥基苯甲酸乙酯含量，g/kg；

c——上機待測液濃度，mg/mL；

v——提取液體積，mL；

m——樣品的質量，g。

2.2 不確定度來源分析

氣相色譜—質譜聯用法測定食用檳榔中對羥基苯甲酸乙酯的不確定度分量主要來自以下幾個方面［3－9］（圖2）。

2.3 測量不確定度評定

2.3.1 重復性試驗引入的不確定度 在重復性條件下，食用檳榔樣品10次測定對羥基苯甲酸乙酯含量，測定結果見表1。重復性引入的不確定度屬A類評定。

表1 重復性測定樣品的結果Table 1 Repeated measurements of the sample results

計算測得的樣品含量平均值為：

用貝塞爾公式計算試驗標準差：

重復性引入的標準不確定度：

重復性引入的相對不確定度為：

2.3.2 標準溶液引入的不確定度評定

（1）標準物質的標準值引起的不確定度：本試驗方法中擬合校正曲線及分析樣品時選用的對羥基苯甲酸乙酯的標準物質［編號GBW（E）100064］，證書提供標準值為99.7%，相對擴展不確定度為0.2%，k＝2，其相對不確定度為：

（2）標準品稱量引入的不確定度：天平稱量時對示值量化的不確定度服從均勻分布。天平分辨力為0.1mg，區間半寬度為0.05mg，由此引入的相對不確定度為：

同一樣品連續稱重3次，采用極差法計算標準偏差［3］：S（m）＝R/C，其中R為極差，R＝0.000 2g；C為極差系數，經查表n＝3時極差系數為1.69，則相對不確定度為：

合成天平稱量不確定度：

（3）標準溶液配制時引入的不確定度：本試驗方法中對羥基苯甲酸乙酯標準儲備液，是稱取0.05g標準品，用乙酸乙酯溶解，準確定容至50mL容量瓶中。分別移取0.5，1，2，3，4，5mL標準儲備液到10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/mL的標準工作液。在此過程中的不確定度，主要由所用的1mL A級吸量管，10，50mL容量瓶的不確定度和溫度影響的不確定度組成。

①1mL A級吸量管引入的不確定度：根據JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》，1mL A級吸量管的最大允差為±0.007mL。按均勻分布，引入的不確定度為：

1mL吸量管校正溫度為20℃，試驗溫度15℃，溫度波動5℃，乙酸乙酯膨脹系數是1.38×10－3℃－1，按均勻分布考慮，溫度引入的不確定度為：

其相對不確定度為：

② 同理，10mL容量瓶引入的不確定度為：

溫度引入的不確定度為：

其相對不確定度為：

③ 同理，50mL容量瓶引入的不確定度為：

溫度引入的不確定度為：

其相對不確定度為：

則配制標準溶液過程中引入的相對不確定度為：

（4）標準工作溶液的相對不確定度：

2.3.3 稱量引入的不確定度評定 樣品稱量與標準物質稱量為同一天平，同2.3.2，天平引入的相對不確定度為：

同一樣品連續稱重3次，相對不確定度為：

合成天平稱量不確定度：

2.3.4 提取液體積引入的不確定度評定 本試驗方法提取溶液體積為10.00mL，同2.3.2，10.00mL吸量管引入的標準不確定度為：

溫度引入的不確定度為：

其相對不確定度為：

2.3.5 儀器引入的不確定度

（1）自動進樣針進樣體積引入的不確定度：10μL氣相色譜自動進樣針示值最小刻度為0.2μL，實際最大誤差以0.02μL計［4］，進樣體積1μL，進樣體積服從均勻分布，其相對標準不確定度為：

（2）載氣流速引入的不確定度：JJG 700—1999中對于載氣流速穩定性的要求是：10min之內，波動范圍不超過±1%。本試驗以此上限和下限來考核評定載氣流速引入的不確定度。

（3）氣相色譜柱箱溫度控制引入的不確定度：JJF 1164—2006中對于氣相色譜柱箱溫度穩定性的要求是：10 min之內，程序升溫重復性優于±2%。本試驗以此上限和下限來考核評定載氣流速引入的不確定度。

（4）GC—MS重復性引入的不確定度：在重復性條件下，對同一對羥基苯甲酸乙酯標準溶液連續進行10次測定，所得峰面積見表2。重復性引入的不確定度屬A類評定。

表2 對羥基苯甲酸標準溶液的峰面積Table 2 Peak area of p-hydroxy benzoic acid ethyl ester standard solution

計算測得的對羥基苯甲酸乙酯標準溶液峰面積平均值為：

用貝塞爾公式計算試驗標準差：

重復性引入的標準不確定度：

重復性引入的相對不確定度為：

（5）合成儀器的相對標準不確定度為：

2.3.6 樣品測定過程產生的不確定度

（1）校正曲線擬合引入的不確定度：對各對羥基苯甲酸標準工作溶液測定3次（表3），以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

得擬合標準曲線方程：y＝ax＋b，a＝7 247 721 014.57，b＝0，R2＝0.999 4。標準工作曲線擬合引入的不確定度ucu由式（2）計算［3］：

表3 對羥基苯甲酸標準溶液的峰面積峰面積AiTable 3 Peak area of p-hydroxy benzoic acid ethyl ester standard solution

其中：

式中：

S——擬合標準曲線的標準偏差；

a——標準曲線斜率，7 247 721 014.57；

b——標準曲線截距，0；

n——標準曲線濃度點數，18；

p——樣品重復測定次數，10；

Ci——標準點濃度值，mg/mL；

——標準濃度Ci對應的平均峰面積。

標準曲線擬合引入的相對不確定度：

（2）回收率引入的不確定度：氣相色譜—質譜聯用法測定食品中對羥基苯甲酸乙酯含量，要經過渦旋提取、超聲提取、離心沉淀、過濾膜等步驟。如果對每一步驟進行不確定度評定，部分難以確定的因素評定起來會有一定的難度，本試驗方法以回收率來進行綜合評定。待測樣在回收率的試驗中，是被設定為與實際檢測進程相同的載體條件。

對食用檳榔中對羥基苯甲酸乙酯進行回收率試驗，6次試驗結果回收率在91.4%～112.1%，回收率的可能值的上界、下界與最佳估計值100%不對稱。在有效信息短缺的情況下，按均勻分布來處理不確定度評定，由此產生的標準不確定度采用式（4）計算［5］：

式中：

U（rec）——樣品測定過程中回收率的標準不確定度；

b＋——回收率按其估計值的偏差上限；

b-——回收率按其估計值的偏差下限；

k——回收率界限不對稱時，k＝12。

相對不確定度為：

樣品測定過程產生的不確定度：

2.4 合成標準不確定度

綜上所述，各不確定度分量對合成不確定度的影響分布見圖3。

圖3 測量不確定度分量分布示意圖Figure 3 Distribution diagram of each component of uncertainty

在不考慮各輸入量之間的相關性的情況下，以方和根合成相對標準不確定度：

2.5 擴展不確定度

在置信概率取95%的情況下，包含因子k＝2。相對擴展不確定度為：

由試驗數據的平均值計算得該食用檳榔樣品中對羥基苯甲酸乙酯含量的最佳估計值：

X＝0.186（g/kg）

故其擴展不確定度為：

U95＝0.186×0.127≈0.024（g/kg）

該食用檳榔樣品中對羥基苯甲酸乙酯含量的測量不確定度報告：

X＝（0.186±0.024）g/kg（包含因子k＝2，置信概率95%）。

3 結論

以氣相色譜—質譜聯用法測定食用檳榔中對羥基苯甲酸乙酯為例，對測定食用檳榔中對羥基苯甲酸乙酯的測量不確定度來源進行了分析和量化評定，結果表明測定過程中的回收率、氣相色譜—質譜聯用儀、測量重復性分量對不確定度的影響較大，而質量、提取液體積等對測量不確定度影響較小。因此要減小不確定度，得到準確性高的測量結果，應選用穩定性好的儀器、選擇合理的測定方法，并規范檢驗操作。

1 國家質量監督檢驗檢疫總局.JJF 1059.1－2012測量不確定度評定與表示［S］.北京：中國計量出版社，2012.

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3 丁進鋒，趙鳳敏.氣相色譜測定大米粉中O，P’-DDT不確定度分析［J］.食品與機械，2013，29（5）：80～83.

4 邵華，劉肅，錢永忠，等.氣相色譜—質譜聯用法測定樂果的不確定度評定［J］.分析試驗室，2006，25（6）：84～87.

5 常曉途，陳新煥，楊代明，等.直接測汞儀測定大米中汞的不確定度評定［J］.食品與機械，2010，26（3）：85～87.

6 曹小彥，張燕，黃雄偉，等.氣相色譜法測定葡萄酒中甲醇含量不確定度評定［J］.食品與機械，2013，29（6）：76～78.

7 殷俊，黎瑛，周金沙，等.原子熒光法測定罐頭食品中錫含量的不確定度評定［J］.食品與機械，2012，28（3）：68～70.

8 李淑靜，陳其勇，宓捷波，等.氣相色譜—質譜法測定葡萄酒中鄰苯二甲酸二丁酯含量的不確定度評定［J］.食品安全質量檢測學報，2014，5（9）：2 899～2 902.

9 國家質量監督檢驗檢疫總局.JJG 196—2006常用玻璃量器檢定規程［S］.北京：中國計量出版社，2007.