新型凹土基益生菌乳化液制備研究

趙玉萍 王煨捷 楊 莉

（淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇 淮安 223003）

凹土是凹凸棒石黏土的簡稱，是天然非金屬富鎂鋁硅酸鹽黏土礦物，表面含有大量極性羥基，是一維納米棒晶形態結構，其獨特的晶體結構和堆積方式，使凹土具有較好的膠體性能、吸附能力等優點［1，2］，還具有保護消化道黏膜、作為營養元素載體、促進養分吸收及吸附有毒物質等生物活性功能［3］。凹土作為一種新型材料已廣泛應用于醫藥、化工、石油、建材、農業和環保等領域［4］。

乳酸桿菌是能夠產生乳酸的革蘭氏陽性菌，廣泛存在于人和動物的胃腸道內，是具有重要生理功能的腸道益生菌［5］。

益生菌常見微膠囊產品在一定程度上能夠對人和動物胃腸道逆環境具有一定的耐受性，但常見微膠囊生產工藝比較復雜，成本也高，其粒徑分布一般為微米級，若作為食品或飼料添加劑，分散性不好［6］。本研究擬以大豆分離蛋白、植物油復合凹土制備成乳狀液，盡管該乳狀液具熱力學不穩定性，但因其粒徑小且分布范圍較窄，所以作為食品或飼料添加劑使用時較為方便。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸桿菌：本實驗室保藏；

臺式高速冷凍離心機：TGC-16G-A型，上海安亭科學儀器廠；

紫外光柵分光光度計：752型，上海精密科學儀器有限公司；

恒溫恒濕培養箱：HWS智能型，寧波新江南儀器有限公司；

pH酸度計：PHSJ-4A型，上海精密科學儀器有限公司；

大豆分離蛋白：生化試劑，北京奧博星生物試劑有限公司；

植物油：食品一級，金龍魚股份有限公司；

凹土：原礦，盱眙博圖凹土高新技術開發有限公司；

胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖：生化試劑，日本Sigma公司；

其他試劑：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 培養基及人工胃、腸液配制方法

1.2.1 MRS培養基 蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5 g，磷酸氫二銨2g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，吐溫80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，H2O 1 000mL，pH 6.2～6.4，121℃滅菌15min［7］。

1.2.2 人工胃、腸液

（1）人工胃液：胃蛋白酶1%，NaCl 0.2%，用1mol/L HCl調節pH 至2.5［8］。

（2）人工腸液：胰蛋白酶1%，KH2PO41.4%，用0.4%的 NaOH 調節調節pH 至6.8［8］。

人工胃液和腸液配好后用0.2μm濾膜過濾備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌懸液的制備 乳酸桿菌接種于 MRS培養基，于37℃培養24h，于7 000r/min離心12min棄上清液，取菌泥沉淀，以無菌生理鹽水離心洗滌2次后，將菌體懸浮于無菌生理鹽水中，并將菌體濃度調節至108CFU/mL。

1.3.2 凹土的處理 將未經處理的凹土研磨，200目過篩，以10%的量加入去離子水，磁力攪拌器攪拌24h后，靜置4 h，取中間層凹土懸液，以10%的量加入去離子水，重復3次。懸浮于去離子水中，使 OD值達1.5，備用［8］。

1.3.3 大豆分離蛋白的處理 將7%（m/V）的大豆分離蛋白溶 于 0.7mol/L 的 HCl中，調 節 pH 至 4.5，于 8 000r/min離心棄上清，并用去離子水補足至初始體積，以1 mol/L的NaOH調節pH至10，靜置澄清后待用［9］。

1.3.4 乳化液制備方法 大豆分離蛋白與凹土混合制備懸液，滴入含0.2%吐溫80的植物油中，攪拌，靜置30min，使乳化層和水層及油層分離，得到乳化層。

（1）水包油（O/W）型乳化液制備：O/W 型乳化液是將油相高度分散在水相中，本試驗中以植物油為油相，與處理后的大豆分離蛋白、凹土及菌懸液形成的水相混合制成穩定的乳化液，但該乳化液的形成是非自發過程，因此需要加入表面活性劑吐溫80。經多次單因素試驗確定最佳添加順序為：在菌懸液中依次添加凹土懸液、大豆分離蛋白、植物油及吐溫80。乳酸桿菌懸液濃度為4.8×108CFU/mL，按上述的順序依次加入，振蕩10min后靜置30min，待油層、乳化層和水層逐漸分層后，取中間乳化層，采用稀釋涂布法，于MRS培養基中涂布，得乳化包埋活菌數，計算包埋率，以直接測量法測量各試樣乳化度，并用SDS分光光度法再次驗證乳化的效果。

（2）油包水（W/O）型乳化液制備：W/O型乳化液即將水相高度分散在油相中，將油相和水相各組成成分進行單因素試驗，獲得最佳乳化條件。

（3）正交試驗：比較O/W和 W/O型乳化液各項指標，選擇最佳乳化液，在單因素試驗基礎上進行正交試驗，獲得最優乳化條件。

1.3.5 菌體檢測方法

（1）水包油型包埋率［10，11］：取乳化層經梯度稀釋后，于MRS培養基中涂布，測定CFU，計算包埋后總菌體CFU，以此數值除以起始總菌體數CFU，得水包油型菌體包埋率。

（2）油包水型包埋率［10，11］：取未包埋部分液體，測定CFU，計算未包埋總菌體CFU，以此數值除以起始總菌體數CFU，得未包埋率，再按式（1）計算油包水型包埋率。

（3）釋放率：在人工模擬胃腸環境中，每隔1h或2h取樣，于MRS培養基中涂布，測定CFU，計算人工胃腸液總CFU，以此數值除以乳化樣品中總菌體數CFU，得菌體釋放率。

1.3.6 乳化性能測定方法

（1）直接測量法：按1.3.5制備乳化液，靜置后呈現油、乳液、水3個清晰的界面，測量乳化層體積、試樣總體積，運用式（2）計算乳化能力（Ec）［12］。

（2）分光光度法：以0.1%（m/V）SDS為空白，并用其稀釋乳化液，于500nm處測量各樣品吸光度值。由于SDS是表面活性劑，與油作用后即可破乳，因此0min時的吸光度值可表示乳化試樣的乳化性［13］。

2 結果與討論

2.1 水包油乳化液制備試驗結果

由表1可知，水包油的包埋率都在50%～70%，多數為60%左右。且包埋效果和乳化性能相關參數，即直接測量法結果和分光光度法測定乳化性的結果相對應。但本試驗組的最佳乳化效果仍然不明顯，并且試驗中各組試樣均存在一定的絮狀沉淀。

2.2 油包水乳化液制備試驗結果分析

由表2、3可知，油包水的包埋率普遍都比水包油的高，最高達到了85.11%。經過直接測量法和產品乳化性能測定，油包水型中分離蛋白、吐溫80、凹土和植物油的添加量分別為2.0，1.0，1.5，3.0mL。以此試驗參數設計正交試驗。

2.3 油包水乳化條件正交試驗優化結果

根據上述單因素優化結果，選擇大豆分離蛋白、凹土、吐溫80和植物油的量4個因素進行優化，設計4因素3水平正交試驗，因素及水平見表4。試驗菌液濃度為5.6×1010CFU/mL，以乳化性為評價指標，試驗結果見表5。

由表5可知，4個因素中對乳化性影響的顯著程度為：植物油＞凹土＞大豆分離蛋白＞吐溫80，乳化最佳條件為：大豆分離蛋白含量為2.0mL、凹土含量為1.5mL、吐溫80含量為1.4mL、植物油含量為3mL。

根據正交試驗的結果，A2B2C3D2組是最優條件，在此條件下進行驗證實驗，乳化性達到了2.176，每毫升活菌數為5.171×1010CFU，包埋率為92.31%。

表1 水包油型試驗結果Table 1 Results of the oil-in-water type

表1 水包油型試驗結果Table 1 Results of the oil-in-water type

菌、植物油、凹土均為1mL。

分離蛋白量/mL吐溫80/mL包埋率/%乳化能力/% OD500nm 0.2 64.56 21.74 1.032 1 0.6 70.23 28.00 1.175 1.0 70.71 28.57 1.328 0.2 62.31 19.23 1.245 2 0.6 62.67 19.64 1.178 1.0 64.50 21.64 1.213 0.2 62.41 19.35 1.278 3 0.6 60.00 16.67 1.112 1.0 61.71 18.57 1.008 0.2 63.75 20.83 0.912 4 0.6 63.95 21.05 0.958 1.0 64.12 21.25 0.745 0.2 66.95 17.36 0.902 5 0.6 55.46 11.62 0.933 1.0 50.40 16.00 0.701

表2 油包水型試驗分離蛋白和吐溫80測定結果Table 2 Results of the water-in-oil type of soy protein and Tween 80

表2 油包水型試驗分離蛋白和吐溫80測定結果Table 2 Results of the water-in-oil type of soy protein and Tween 80

菌、凹土均為1mL，植物油2mL。

分離蛋白量/mL吐溫80/mL包埋率/%乳化能力/% OD500nm 0.2 75.11 38.46 1.122 1 0.6 74.25 37.50 1.346 1.0 78.00 41.67 1.612 0.2 70.98 40.87 1.678 2 0.6 67.77 45.30 1.787 1.0 83.20 58.57 1.913 0.2 66.75 29.17 1.812 3 0.6 64.19 26.32 1.511 1.0 74.25 37.50 1.642 0.2 62.45 24.39 1.213 4 0.6 58.28 19.76 1.387 1.0 61.50 23.33 1.125 0.2 61.04 22.82 0.937 5 0.6 58.31 19.79 1.131 1.0 63.00 25.00 0.911

表3 油包水型試驗凹土和植物油測定結果Table 3 Results of the water-in-oil type of attapulgite clay and vegetable oil

表3 油包水型試驗凹土和植物油測定結果Table 3 Results of the water-in-oil type of attapulgite clay and vegetable oil

分離蛋白2mL，菌、吐溫80 1mL。

凹土/mL植物油/mL包埋率/%乳化能力/% OD500nm 1 59.12 17.81 0.765 0.25 2 60.17 16.73 0.874 3 61.32 19.28 0.933 1 58.91 18.22 0.976 0.50 2 62.11 17.35 0.982 3 64.65 20.37 1.105 1 63.52 27.81 1.032 0.75 2 69.76 30.97 1.137 3 72.52 35.89 1.165 1 77.65 42.31 1.178 1.00 2 83.20 58.57 1.913 3 75.63 41.79 1.213 1 63.84 41.26 1.312 1.25 2 73.12 38.79 1.129 3 82.27 56.35 1.539 1 82.14 57.65 1.891 1.5 2 84.38 60.29 1.957 3 85.11 61.32 1.975 1 83.19 59.93 1.879 1.75 2 80.26 55.37 1.653 3 82.17 58.54 1.732

表4 因素水平表Table 4 Factors and levels table mL

2.4 油包水乳化液人工模擬胃液和腸液中存活結果

將上述各組乳化試樣，模擬人工胃液和腸液，檢測各時間段活菌數。各組試樣在人工胃液和腸液中活菌數見圖1、2。

各試驗組在胃中隨著時間的增加有所下降，在腸中活菌數剛開始隨著時間的增加而增加，即菌體不斷釋放的過程，普遍在第6小時時達到最大，之后又逐漸衰減，即使在10h后，活菌數數量仍超過108CFU/mL，因此該乳油能夠很好地發揮乳酸桿菌的作用。比較各試驗組，其中又以3號試驗組在腸中的活菌數釋放最高，在人工腸液的第6小時達到最大釋放效率。

表5 正交試驗結果Table 5 Orthogonal results of conditions

圖1 人工模擬胃液各時間段活菌數Figure 1 CFU of emulsiton in artificial simulation gastric juice

圖2 人工模擬腸液中各時間段活菌數Figure 2 CFU of emulsiton in artificial simulation intestinal juice

3 結論

本試驗以凹土懸液、大豆分離蛋白、植物油及吐溫80制備乳酸桿菌水包油型乳化液，水包油型乳化液包埋率低，乳化能力一般；油包水型乳化液，包埋率好，乳化性能好，在人工模擬胃液中存活率高，在人工模擬腸液中第6小時可達到益生菌的最大釋放，有利于益生菌很好地發揮腸定植作用。說明采用凹土復合大豆分離蛋白和植物油制備的油包水型乳化液，可以很好地包埋益生菌，抵抗胃的逆環境，以較高的存活率到達腸道，并在腸道中達到最高量的釋放。本試驗為更好地開發益生菌保護劑材料提供了較好的參考，同時為凹土作為新型材料在食品和醫藥領域的應用提供參考。

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