清香型大曲細菌群落結構的比較分析

葉光斌 王彩虹 王 毅 甄 攀 王 勇 羅惠波

（1.四川理工學院生物工程學院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000；3.五糧液集團質量檢測中心，四川 宜賓 644000；4.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 汾陽 032200）

清香型大曲是中國大曲清香型白酒的生產用曲，主要包括清茬曲、紅心曲和后火曲3種大曲。這3種大曲在生產上使用的原材料相同，生產流程也基本相似，可簡單概括為：臥曲→上霉期→晾霉期→潮火期→干火期→后火期→養曲→出房驗收→貯曲。所不同的是在培曲過程中，各曲種對培曲溫度的要求各不相同（見表1）。不同的制曲溫度及生產工藝，使得不同大曲內的微生物生長和發酵特征各具特色，其產生的不同代謝產物對白酒風味形成也有所差異［1］。清香型白酒生產中將清茬曲、紅心曲和后火曲按照4∶3∶3的比例混合后使用［2］。采用不同工藝生產的3種大曲共同發酵，相輔相成，便形成了清香型白酒（大曲清香）獨特的風格。因此，認識清香型大曲內不同曲種間微生物群落結構與差異，對于研究清香型白酒發酵具有十分重要的意義。

原核細胞核糖體小亞基16SrRNA基因，長約1.5kb左右，大小適中，既含有高度保守的基因片段又具有種間變異的核酸片段，非常適合于進行序列測定和菌屬間的分析比較，是理想的基因鑒定靶序列［3］。張守印等［4］對16SrDNA克隆文庫用于細菌群落分析的可靠性進行了研究，結果表明，16SrRNA基因序列分析可以反映菌群中各種細菌的豐度，是一種較好的分析細菌菌群的方法。目前，16SrRNA基因克隆文庫技術也已被廣泛應用于發酵食品［5，6］、城市污水［7］、土壤［8］等各類復雜環境中細菌微生態的研究。

本研究擬以汾酒清香型大曲—清茬曲、后火曲、紅心曲為研究對象，通過提取大曲微生物總DNA、PCR擴增及構建細菌16SrRNA基因文庫，對其細菌群落組成進行了比較研究，確定了3種大曲的優勢菌群，為進一步解析清香型大曲功能微生物、篩選優良釀造微生物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大曲樣品：采集自山西杏花村汾酒集團有限責任公司，全部為成品曲（見表1）。每個大曲樣品取3個平行，按“四分法”［9］將不同類型大曲分別粉碎混合，用無菌封口袋分裝后，置于－80℃保藏備用。

引物：由上海英俊生物技術有限公司合成；

Taq酶、pMD19-T載體和EscherichiacoliDH5α感受態細胞、限制性內切酶MspI和HhaI：大連寶生物有限公司；

PCR儀：BIO-RAD Thermal Cycle型，美國 BIO-RAD公司；

離心機：Eppendorf Centrifuge 5418型，美國Eppendorf公司。

表1 試驗所用大曲樣品信息表Table 1 Information of Daqu samples of the experiment

表1 試驗所用大曲樣品信息表Table 1 Information of Daqu samples of the experiment

來源山西杏花村。

名稱 類型（制曲最高品溫） 所產白酒香型汾酒清茬曲 中溫曲（45～46℃）清香型清香型汾酒后火曲 中溫曲（46～48℃） 清香型汾酒紅心曲 中溫曲（最高可達50℃）

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA的提取及PCR擴增 DNA提取參照文獻［10］。引物 Eub27f（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和 Eub1492r（5’-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3’）用于擴增細菌16SrDNA［11，12］，為了防止 PCR 偏差，每個樣品做3個重復。具體的PCR擴增體系及PCR擴增程序同葉光斌等的方法［10，12］。

1.2.2 細菌16SrRNA基因克隆文庫的構建 將純化后的PCR產物與pMD-19T載體16℃過夜連接，通過熱激法（42℃熱激90s）將連接產物轉化到感受態細胞E.coliDH5α（感受態細胞的效價約108個/μg）中。

1.2.3 陽性克隆子的篩選及RFLP分析 菌落PCR篩選陽性克隆 子。引 物 RV-M（5＇-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3＇）和 M13-47（5＇-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3＇）用于菌落PCR擴增。PCR擴增體系及PCR擴增程序同葉光斌等的方法［10，12］，利用MspI和HhaI雙酶切陽性克隆子菌落PCR產物的酶切圖譜，確定不同譜型，統計每一譜型出現的頻率及數目，并將不同譜型的克隆子送到上海杰李生物技術有限公司進行DNA測序。

1.2.4 數據分析 將16SrDNA序列相似性≥97%的序列定義為同一OTU（operational taxonomic units，運算分類單位）［10，12］。根據測序結果和RFLP統計分析結果，統計各文庫內OTU數目及每個OTU在個克隆文庫的分布比例。將每個OTU的代表克隆子序列與NCBI數據庫進行比對，找出與克隆子序列同源性最高的序列，用于構建系統發育樹和確定其分類地位。Seaview4軟件對齊序列，Mega 4軟件構建系統發育樹。文庫的評估方法參考葉光斌等的方法［10，12］。共有32個克隆子的16SrRNA基因序列上傳至NCBI Gen-Bank數據庫，GenBank序列號為KF984353-KF984384。

2 結果與分析

2.1 細菌16SrRNA基因的PCR擴增

不同大曲細菌16SrRNA基因PCR擴增產物的瓊脂糖電泳圖譜見圖1。由圖1可知，3種大曲樣品的細菌16SrDNA PCR擴增效果都很好，均得到了一條較亮的1 500bp左右的目的條帶。

圖1 細菌16SrRNA基因PCR產物的電泳圖譜Figure 1 The electrophoresis diagram of PCR products of bacterial 16SrRNA gene

2.2 陽性克隆子檢測及RFLP分析

部分菌落PCR產物電泳圖譜見圖2。菌落PCR產物為單條帶，且片段長度在1 600bp左右的均可視為陽性克隆子。清茬曲、后火曲和紅心曲細菌16SrRNA基因文庫內分別有45，60和45個陽性克隆子用于后續的RFLP分析。將各文庫的陽性克隆子菌落PCR產物通過MspI和HhaI雙酶切后，進行RFLP分析，部分RFLP電泳圖譜見圖3。不同大曲樣品根據RFLP分析結果，挑選不同譜型的32個代表克隆子進行測序，并與NCBI GenBank數據庫比對（見表3）。

圖2 部分克隆子菌落PCR產物電泳圖譜Figure 2 The electrophoretogram of colony PCR products of partial colonies

圖3 部分陽性克隆子菌落PCR產物雙酶切產物電泳圖譜（MspI和HhaI雙酶切）Figure 3 The electrophoretogram of double enzyme digested products from PCR products of partial positive colonies（Digested with MspI and HhaI）

2.3 細菌16SrRNA基因文庫的評估

3種大曲細菌16SrRNA基因文庫的統計結果見表2。從文庫覆蓋率上看，在64%～72%，均未達到飽和；Shannon指數和Simpson指數顯示3種清香型大曲內細菌群落多樣性豐富；且從物種多樣性上看，后火曲＞清茬曲＞紅心曲。Buzas-Gibson均一度指數的分析結果表明，紅心曲＞后火曲＞清茬曲。盡管以上3個文庫均未達到飽和，但該文庫能在一定程度上反映各樣品內的主要細菌類群的多樣性及豐度差異。

2.4 清香型大曲細菌群落結構

清茬曲、后火曲、紅心曲的細菌16SrRNA基因文庫內代表克隆子在文庫中的分布及NCBI數據庫比對信息見表3。由表3可知：克隆子與對應序列間的相似度均達到98%以上。代表克隆子參與構建的系統發育樹見圖4。由圖4可知，所有清香型大曲內細菌群落主要分布于芽孢桿菌綱、放線菌綱及變形菌綱。芽孢桿菌綱內克隆子主要分布于乳桿菌目（Lactobacillales）和芽孢桿菌目（Bacillales）。其中乳桿菌目內克隆子種類最多，共有11個OTUs，主要分布于乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串株菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）；芽孢桿菌目內克隆子包含有5個OTUs，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）。放線菌綱內克隆子主要分布于放線菌目（Actinomycetales）內的鏈霉菌屬（Streptomyces）、短桿菌屬（Brevibacterium）、考克氏菌屬（Kocuria）及Brachybacterium屬。變形桿菌綱內克隆子主要分布于不動桿菌屬（Acinetobacter）和泛菌屬（Pantoea）。

表2 不同清香型大曲細菌16SrRNA基因文庫的統計分析Table 2 The statistical analysis of bacterial 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

表2 不同清香型大曲細菌16SrRNA基因文庫的統計分析Table 2 The statistical analysis of bacterial 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

通常Shannon-Wiener指數數值越大，表明文庫中克隆子多樣性越豐富；Simpson指數越接近1，表明文庫中克隆子多樣性越豐富；Buza-Gibson均一度指數越接近1，表明文庫中克隆子分布越均勻［10，12，13］。

文庫來源 克隆子數目 OUT數目 文庫覆蓋率/%Buzas-Gibson均一度指數清茬曲Shannon-Wiener指數Simpson指數45 13 71.11 2.39 0.89 0.84 45 16 64.44 2.51 0.90 0.78后火曲 60 19 68.33 2.71 0.92 0.79紅心曲

從克隆子分布表和系統發育樹可以看出：乳桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、明串株菌屬在3個大曲中同時存在；高溫放線菌屬只存在于制曲品溫較高的后火曲和紅心曲中；乳球菌屬和短桿菌屬只存在于清茬曲和后火曲中；泛菌屬只存在于清茬曲和紅心曲中；考克氏菌屬和短桿菌屬是清茬曲的特有菌群；鏈霉菌屬和不動桿菌屬是后火曲的特有菌群。其中，清茬曲的優勢菌群為乳桿菌屬（占全部克隆子的比例為37.78%，7OTUs）和葡萄球菌屬（22.22%，1OTU）；后火曲的優勢菌群為乳桿菌屬（占全部克隆子的 比 例 為 35%，8OTUs）、葡 萄 球 菌 屬 （16.67%，2 OTUs）、芽孢桿菌屬（16.67%，2OTUs）、魏斯氏菌屬（13.33%，1OTU）；紅心曲的優勢菌群為乳桿菌屬（占全部克隆子的比例 為 26 .67%，6OTUs）、芽 孢 桿 菌 屬 （28.89%，2 OTUs）、高溫放線菌屬（17.78%，1OTU）。總體而言，清香型3種曲的細菌群落結構存在一定的差異，后火曲分別與清茬曲和紅心曲比較相似，而清茬曲和紅心曲間群落相似性較低。

據周恒剛［14］、胡承等［15］報道，制曲品溫在30℃左右較適合微生物的生長，而隨著溫度的上升微生物的活菌數也呈倍下降，大多數不耐高溫的細菌逐漸死亡。汾酒3種大曲微生物群落的差異與大曲生產過程中溫度的控制密切相關。

紅心曲制曲溫度最高，因此耐高溫的芽孢桿菌和高溫放線菌與不耐高溫的細菌相比具有較大的競爭優勢，在文庫中占了較高的比例，但細菌群落多樣性較其它兩種曲低；后火曲的制曲溫度較清茬曲的高，因此后火曲中芽孢桿菌所占的比例明顯高于清茬曲，后火曲中也有較低含量的高溫放線菌分布；而清茬曲制曲溫度最低，未檢測到高溫放線菌的存在。不同的制曲溫度使得微生物的生長和發酵特征也各具特色，其產生的不同代謝產物對白酒風味形成也有所差異，汾酒采用不同工藝生產的3種大曲共同發酵，三者相輔相成，便形成了汾酒獨特的風格。

表3 不同清香型大曲細菌16SrRNA基因文庫內代表克隆子的分布及比對信息Table 3 Blast and distribute information of represental clones from 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

表3 不同清香型大曲細菌16SrRNA基因文庫內代表克隆子的分布及比對信息Table 3 Blast and distribute information of represental clones from 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

“QCQX”、“HHQX”、“HXQX”分別代表清茬曲、后火曲、紅心曲細菌16SrDNA文庫克隆子。

代表克隆子編號清茬曲分布比例/%后火曲分布比例/%紅心曲分布比例/% 近似序列號 相似率/%分類信息QCQX-12 11.11 5.00 4.44 AB605665 99 Lactobacillus paralimentarius QCQX-88 8.90 6.67 6.67 HQ322272 99 Lactobacillus sp.HHQX-18 4.44 3.33 4.44 AB598972 99 Lactobacillus sp.QCQX-4 4.44 5.00 4.44 NR＿036788 99 Lactobacillus pontis QCQX-74 4.44 1.67 4.44 NR＿075038 99 Lactobacillus sanfranciscensis HHQX-81 2.22 3.33 0.00 EF120367 99 Lactobacillus brevis HHQX-9 2.22 3.33 2.22 EF536361 99 Lactobacillushelveticus HHQX-2 0.00 6.67 0.00 DQ399353 99 Lactobacillusparacasei QCQX-7 8.90 6.67 8.90 NR＿074694 99 Leuconostoc citreum HHQX-20 8.90 13.33 4.44 DQ321751 99 Weissella sp.QCQX-58 4.44 1.67 0.00 AB601163 99 Lactococcus lactis subsp.lactis HXQX-70 0.00 5.00 17.78 AJ251778 99 Thermoactinomyces sanguinis QCQX-33 22.22 13.33 0.00 NR＿024667 99 Staphylococcus sp.HHQX-16 0.00 3.33 4.44 EU855191 99 Staphylococcus sciuri HHQX-8 0.00 13.33 15.56 JQ291596 99 Bacillus licheniformis HXQX-92 2.22 3.33 13.33 JX680141 99 Bacillus sp.HHQX-14 0.00 1.67 0.00 NR＿041208 98 Streptomyces albus QCQX-27 6.67 1.67 0.00 AY243345 99 Brevibacterium linens QCQX-6 2.22 0.00 0.00 NR＿025502 99 Brachybacterium paraconglomeratum QCQX-65 4.44 0.00 0.00 FJ607312 99 Kocuria koreensis HHQX-32 0.00 1.67 0.00 NR＿074737 99 Acinetobacter baumannii HXQX-16 2.22 0.00 8.90 FJ756354 99 Pantoea sp.

潘勤春等［16］通過PCR—DGGE技術對汾酒大曲細菌群落結構進行了分析，結果表明制曲品溫最低的清茬曲多樣性最豐富，制曲品溫最高的紅心曲群落組成最簡單，后火曲居中，且清茬曲和紅心曲間群落組成差異較大，測序結果表明，清香型大曲內細菌主要為芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、乳酸菌屬、不動桿菌屬、土壤球菌屬，且芽孢桿菌屬和腸桿菌屬為優勢類群。高亦豹［17］運用PCR—DGGE技術對不同工藝大曲（包括汾酒清茬曲、后火曲、紅心曲）的微生物群落結構進行了研究，結果表明清香型大曲中乳酸菌多樣性較豐富，包括Lactobacillu.helveticus、L.panis、L.pontis、L.fermentum、Weissellacibaria；地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌為大曲中的優勢菌；而Thermoactinomycessanguinis僅存在于醬香型大曲中。Zhang等［18］通過454測序技術研究汾酒3種清香型大曲內細菌群落組成，結果表明3種大曲內細菌種群主要分布于厚壁菌門和放線菌門，厚壁菌門是優勢種群，分別占清茬曲、后火曲和紅心曲的72.2%，98.6%，81.4%；乳酸菌種類豐富，主要包括Weissellacibaria、Leuconostoccitreum、Lactobacillussakei、L.pontis、L.paralimentarius和L.mindensis；清茬曲內優勢科為鏈霉菌科和明串珠菌科；后火曲內優勢菌為芽孢桿菌；紅心曲內優勢菌為高溫放線菌科和鏈霉菌科。但未見γ－變形桿菌的報道。本試驗對汾酒大曲的研究中也發現乳酸菌的多樣性非常豐富，芽孢桿菌是紅心曲和后火曲的優勢菌群，這一結論與潘勤春［16］、高亦豹［17］、Zhang［18］等的結論較一致；不同的是在具體的屬種組成比例上存在差異，且本研究得到的細菌多樣性更豐富。此外本研究在清香型大曲的后火曲和紅心曲內均檢測到了較高比例的高溫放線菌（Thermoactinomycessanguinis）。導致以上差異的原因可能是由于試驗方法或試驗樣品的不同導致的。

圖4 清香型大曲細菌克隆子16SrRNA基因系統發育樹Figure 4 Phylogenetic tree of bacterial 16SrRNA gene of Fen-Daqus

3 結論

通過細菌16SrRNA基因文庫法和RFLP指紋技術系統研究了清香型大曲清茬曲、后火曲和紅心曲內細菌群落結構差異。研究結果表明：制曲溫度對于清香型3種大曲內細菌多樣性具有顯著影響，制曲溫度較低的清茬曲和后火曲的細菌多樣性要明顯高于制曲溫度較高的紅心曲。3種大曲的細菌多樣性豐富，均分布于芽孢桿菌綱、放線菌綱及變形菌綱，但在具體種屬組成上存在明顯差異；其中清茬曲的優勢細菌群為乳桿菌屬和葡萄球菌屬；后火曲的優勢細菌群為乳桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬；紅心曲的優勢細菌群為乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬。

此外，本試驗在進行測序序列與NCBI數據庫比對過程中發現，部分克隆子的測序序列與NCBI數據庫中多個同屬不同種菌株的序列相似度都達到98%以上，如代表克隆子HHQX-20，與魏斯氏菌屬的Weissellaconfusa、W.cibaria的相似度均為99%；HXQX-92與芽孢桿菌屬的Bacillus aerophilus、B.stratosphericus、B.pumilus相似度均達到98%以上；QCQX-88與乳桿菌屬的L.farciminis、L.futsaii、L.crustorum的相似度均達到98%以上。而在群落多樣性分析時，由于只將序列相似度≥97%計為同一種OTU類型，因此可能會低估了清香型大曲的細菌多樣性。后期的研究將結合高通量測序技術，以進一步確定以上大曲內的細菌群落組成信息，并有目的的針對清香型大曲的主要細菌類群進行分離、純化和發酵機理的相關研究，以弄清其在清香型白酒固態發酵中的具體作用。

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