芹菜素對甲狀腺癌BCPAP細胞生長及細胞周期的影響

孫 震 鄭 婕 張 莉 趙俊杰 俞惠新

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省原子醫學研究所衛生部核醫學重點實驗室，江蘇 無錫 214063；3.總后勤部軍需物資油料部軍需軍事代表局，北京 100071）

甲狀腺癌通常被認為是惡性程度較低的癌癥，但近年來其發病率逐年走高［1］，特別是乳頭狀細胞癌（PTC）。2006年，美國癌癥學會聲明甲狀腺癌已經成為第六大女性最常被診斷出的癌癥，而且其名次還在逐漸上升，雖然這與近年來的關注度增加有關，但也說明甲狀腺癌這個一度被人們所輕視的癌癥，其發生的普遍性是不容忽視的。雖然大多數的甲狀腺癌是良性的，但仍有5%～20%的甲狀腺癌是惡性的。甲狀腺癌的高發情況也在1985年芬蘭的連續常規尸檢結果［2］中得到了印證：1/3的死于非甲狀腺相關情形的逝者被檢查出患有甲狀腺癌，這種生前未被發現的甲狀腺癌病情并沒有直接導致他們的死亡，也說明低風險的甲狀腺癌的發生率遠比人們想象的要普遍得多。Londero等［3］對1996～2008年丹麥的乳頭狀甲狀腺癌（PTC）發病率的調查中，也發現發病率的不斷走高。在甲狀腺癌中，乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinomas，PTC）是最常見的類型［4］，占比60%～80%；濾泡狀甲狀腺癌（follicular thyroid carcinomas，FTC）占比15%～25%；未分化甲狀腺癌（anaplastic thyroid carcinomas，ATC）和髓樣甲狀腺癌（medullary thyroid cancers，MTC）共占比2%～5%。其中，PTC病人20年內的存活率高達99%，因此PTC通常被認為是一種低風險癌癥［5］。

針對PTC常見的治療方法通常是手術結合放射碘治療［6］和（或）甲狀腺激素抑制治療，但是這些方法存在易產生并發癥和抗性的問題。因此低毒性藥物輔助化療及攝碘被認為是有潛力的解決手段之一。目前，芹菜素被認為是極有潛力的一種低毒性藥物［7］，并因來源廣、價格低等特點而備受關注。

芹菜素具有C6—C3—C6的類黃酮物質典型結構（見圖1），廣泛存在于常見的水果（如柑橘類、蘋果、櫻桃、葡萄等）、蔬菜（如洋蔥、荷蘭芹、綠花椰菜、甜椒、旱芹、大麥、番茄等）和飲品（茶、紅酒）中［8，9］。芹菜素是以水果和蔬菜為主的膳食模式（如地中海飲食）的主要有效成分之一，這些有效成分被認為與此膳食模式群體中高血壓、心血管疾病、肥胖、糖尿病及癌癥的低發生率相關，其他黃酮類物質也有類似的研究結論［10］。除了抗 腫 瘤 作 用［11］外，芹 菜 素 還 具 有 抗 氧 化［12］、抗炎癥、抗菌、抗誘變及抗病毒等功效，因其低毒性而被格外關注。體外研究［13］表明，芹菜素可誘導多種腫瘤細胞凋亡，影響細胞周期分布。但目前尚無關于芹菜素對乳頭狀甲狀腺癌BCPAP細胞的研究。

圖1 芹菜素的化學結構Figure 1 The chemical structure of apigenin

本研究擬從芹菜素對乳頭狀甲狀腺癌BCPAP細胞系的細胞毒性、生長抑制作用及其對細胞周期和凋亡的影響進行研究，并初步探討其抗腫瘤作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑與藥品

芹菜素：純度≥97%，美國Sigma公司。芹菜素溶解于適量的二甲亞砜（DMSO），終濃度為100mmol/L，過濾除菌，－2℃冰箱密封避光保存；

二甲亞砜（DMSO）：美國Sigma公司；

MTT（四氮唑噻唑蘭，四甲基偶氮唑鹽）、TUNEL試劑盒：碧云天公司；

BSA：上海生物工程公司；

RPMI 1640培養基：美國Gibco公司；

新生小牛血清（FBS）：杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 儀器與器材

細胞培養板：6/96孔，美國Corning公司；

酶標儀：μQuant型，美國Bio-Tek公司；

蛋白電泳儀：POWERPAC3000型，美國BIO-RAD公司；

倒置相差顯微鏡：TH4-200型，日本Olympus公司；

細胞培養箱：HEPA Class100型，美國Thermo公司；

雙人單面凈化工作臺：SW-CT-2FD型，蘇州凈化設備有限公司；

高速冷凍離心機：Centrifuge 5415R型，德國Eppendorf公司；

流式細胞儀：FACSCanto型，美國BD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞株與細胞培養 人甲狀腺癌細胞株BCPAP由江蘇省原子醫學研究所提供。BCPAP細胞接種于含10%（V/V）FBS的RPMI1640培養基中，培養箱溫度為37℃，CO2含量5%，飽和濕度下培養，BCPAP細胞為圓形，呈貼壁生長，孵育1～2d后用0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代，選對數生長期的細胞進行試驗。

1.3.2 MTT法檢測芹菜素對BCPAP細胞增殖的抑制作用

取對數生長期的BCPAP細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液后進行細胞計數，在96孔板的每孔種入7 500個BCPAP細胞后，溶劑對照組培養于等體積的100 μmol/L DMSO完全培養基溶液中；給藥組分別在不同濃度的芹菜素完全培養基中孵育24h，其濃度依次為12.5，25.0，50.0，100.0μmol/L，每個濃度設6個復孔。24h作用結束后，加入40μL濃度為2mg/mL的MTT，在37℃下作用4 h顯色，去除上清液后每孔加100μL的DMSO，微量振蕩器震蕩5min，使結晶完全溶解，通過酶標儀在550nm波長下檢測得吸光值數據，試驗重復3次。另外，細胞中加入相同濃度（50μmol/L）芹菜素，分別培養24，48，72h后，按照上述方法測得芹菜素對BCPAP細胞作用不同時間下的吸光值。按式（1）計算細胞增殖抑制率，擬合后求IC50值。

1.3.3 PI單染法檢測芹菜素對BCPAP細胞周期的影響

取對數生長期的BCPAP細胞，以3×105mL－1的密度接種于6孔板中，細胞貼壁后棄去完全培養基，用PBS輕輕地蕩洗1次，換為無血清的RPMI 1640培養基饑餓培養24 h。藥物作用組芹菜素的給藥濃度分別為12.5，25.0，50.0μg/mL，溶劑對照組給予等體積的50μg/mL二甲亞砜（DMSO）。培養24h后，胰蛋白酶消化，1 000r/min離心5 min，用70%的預冷乙醇使細胞懸浮固定，置4℃存放15 min，再次離心收集細胞，加入500μL含50μg/mL溴化乙錠（PI）、50μg/mL RNase A、0.1%Triton X-100的 PBS，常溫避光孵育15min；直接用流式細胞儀以標準程序檢測分析，每組試驗重復3次，結果用ModFit軟件分析。

1.3.4 Western blot法檢測芹菜素對BCPAP細胞周期Cdc25蛋白表達的影響 取對數期的BCPAP細胞，經胰酶消化，重懸后接種到6孔板中，3×105個/孔，37℃培養過夜。不同濃度芹菜素（12.5，25.0，50.0μmol/L）刺激，同時設置50μmol/L的DMSO溶劑對照組。24h后，收集細胞，8 000 r/min離心4min，棄上清，加入適宜體積的細胞裂解緩沖液［150mmol/L NaCl，1%NP-40，0.02%NaN3，10μg/mL PMSF，50mmol/L Tris—HCl（pH 8.0）］，同時加蛋白酶和磷脂酶抑制劑各0.5mL/tube，吹散均勻，置于－70℃冰箱反復凍融3次，12 000r/min離心5min，取上清。BCA法測定蛋白濃度。將定量好的蛋白液按適宜濃度分裝入PCR管，按1︰5（V︰V）加入6×上樣緩沖液，沸水煮5min。將準備好的樣品按預期順序加入到膠板孔道中，經10%SDS—PAGE凝膠電泳，濕法轉膜，硝酸纖維素膜室溫下置于含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中封閉1h，孵育適宜濃度的指定抗體，4℃搖床過夜，次日用TBST緩沖液清洗3次，每次5min，再在室溫下孵育HRP標記的指定二抗1h，Ecl法化學發光后在成像儀中拍照記錄結果，并對條帶的灰度值進行比較分析。

1.3.5 統計學處理 所有數據均來自于3次以上獨立試驗結果的平均值，計量數據以Mean±SEM表示。使用Student’t-test比較兩組間差異，＊P＜0.05代表差異具有顯著性，＊＊P＜0.01代表差異具有高度顯著性。

2 結果與分析

2.1 芹菜素對BCPAP細胞生長的影響

2.1.1 芹菜素濃度對BCPAP細胞生長的影響 BCPAP細胞經12.5，25.0，50.0，100.0μmol/L的芹菜素作用24h后，用MTT法檢測細胞的生長活力，結果見圖2。由圖2可知，在濃度較低的情況下，芹菜素對BCPAP細胞增殖抑制作用較弱，在12.5μmol/L濃度下，其細胞存活率仍保持85.15%；隨芹菜素劑量的增高，BCPAP細胞的存活率呈明顯下降趨勢。

圖2 MTT法檢測不同濃度的芹菜素對BCPAP細胞的生長抑制作用Figure 2 Different concentration of apigenin inhibits BCPAP cell viability by MTT assay

MTT法是基于活細胞線粒體中存在的琥珀酸脫氫酶能使MTT還原為不溶于水的藍紫色結晶甲瓚（formazan）的原理。在一定細胞數范圍內，MTT吸光值與細胞數成正比，以溶劑對照組的吸光值為空白值進行計算與分析。MTT法檢測不同濃度的芹菜素給藥24h后，對BCPAP細胞的生長呈明顯抑制作用，藥物作用24h的IC50值為40.65μmol/L。

2.1.2 芹菜素作用時間對BCPAP細胞生長的影響 采用MTT法檢測濃度分別為12.5，25.0，50.0μmol/L的芹菜素給藥24，48，72h后BCPAP細胞的生長狀態，結果見圖3。

圖3 MTT法檢測不同作用時間下芹菜素對BCPAP細胞的生長抑制作用Figure 3 Apigenin inhibits BCPAP cell viability for different time by MTT assay

由圖3可知，隨著芹菜素作用時間的延長，BCPAP細胞的生長均有不同程度的抑制。其中，50μmol/L的芹菜素對BCPAP細胞作用24，48，72h后，其細胞存活率分別為41.2% ，38.56%，13.99%。

MTT檢測結果表明，BCPAP細胞增殖的抑制率與芹菜素濃度及作用時間密切相關，且不同藥物濃度與對照組間細胞抑制率有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 芹菜素作用BCPAP細胞后的形態學變化

不同濃度芹菜素與BCPAP細胞共培養24h后，在明場下用相差顯微鏡觀察，對BCPAP細胞形態學改變進行觀察、記錄并分析，其形態學變化見圖4。

由圖4可知，與對照組相比，藥物作用組的細胞形態有明顯差異。芹菜素對BCPAP細胞作用之后，BCPAP細胞數目不斷減少，細胞皺縮程度不斷加深，貼壁性變差。

2.3 芹菜素對BCPAP細胞周期的影響

經不同濃度芹菜素處理的BCPAP細胞，在PI染色后使用流式細胞儀進一步檢測分析，以探討芹菜素對BCPAP細胞生長抑制的機理，結果見圖5。

由圖5可知，雖然在DNA組直方圖上沒有出現典型的凋亡細胞峰（亞G1峰，圖5），結合圖6細胞周期所占百分比來看，經芹菜素給藥后，BCPAP細胞G2/M期所占比例隨給藥濃度的增加不斷增大，G0/G1期所占比例則不斷減少，可據此推測細胞周期停滯在G2/M期而無法順利進行，從而導致細胞發生凋亡并最終死亡。

細胞生長受到抑制常與細胞周期進程的改變有關。已有一些研究［14］表明芹菜素在一些細胞系中可以誘導發生細胞周期阻滯。真核細胞中存在一些檢測點來調控細胞分裂周期，包括G1檢測點、G2檢測點和中期檢測點。G2檢測點位于G2期的最后，它關系著有絲分裂M期的觸發起點。

圖4 芹菜素濃度對BCPAP細胞形態學的影響（×200）Figure 4 The effects of different concentration of apigenin to BCPAP cells on morphology（×200）

圖5 芹菜素濃度對BCPAP細胞周期分布影響的流式直方圖Figure 5 Representative flow cytometry histograms of different concentration of apigenin BCPAP to cells on cell cycle

圖6 芹菜素濃度對BCPAP細胞周期分布影響的定量分析柱狀圖Figure 6 Bar graphs of quantitative analysis of different concentration of apigenin to BCPAP cells on cell cycle

2.4 芹菜素對BCPAP細胞Cdc25蛋白表達的影響

在細胞周期的調控中起核心作用的是Cdk/cyclin復合物，其活性受多種因子的調控，Cdc25等可以使Cdk/cyclin去磷酸化而活化，進而利于細胞周期順利通過G2檢測點［15，16］。在細胞生長周期中G2/M期主要受CDK1激酶調控，CDK1激酶（即有活性的MPF）是由P34cdc2蛋白和細胞周期蛋白cyclin B組成［14］。CDK1蛋白本身不具有蛋白激酶的活性；當cyclin A/B含量積累到一定值時，兩者相互結合成復合體，結合cyclin的CDK1被Wee1將Thr14和Tyr15磷酸化，并被CDK激活激酶將Thr161磷酸化。在M期，Wee1的活性下降，cdc25使CDK1的Thr14和Tyr15去磷酸化，其激酶活性才能表現出來［17］，Cdc2活性的缺失直接導致細胞周期無法順利進行，因而出現G2/M期阻滯現象。而且Cdc25也參與DNA損傷所引起的檢測點應答，故試驗結果中的阻滯有可能是芹菜素引發DNA損傷導致的結果，BCPAP細胞增殖受到明顯抑制可能是凋亡級聯反應引起的。

Cdc25蛋白對控制細胞有絲分裂進入M期和通過G 2/M期檢測點具有重要的作用［14］，研究證明Cdc25在多種癌癥中呈現出過表達狀態。圖7所示為不同濃度的芹菜素對BCPAP細胞中Cdc25蛋白表達的Western blot條帶和光密度值分析結果。由圖7可知，在芹菜素的作用下，BCPAP細胞中Cdc25蛋白的表達量隨藥物濃度的升高而明顯下降，表明細胞中Cdk/cyclin復合物活性降低，此現象是細胞G 2/M期阻滯的標志，進而使細胞增殖速度減慢。

圖7 Western blot法檢測不同濃度芹菜素對BCPAP細胞Cdc25蛋白表達的影響Figure 7 The effects of different concentration of apigenin to BCPAP cells on the expression of Cdc25

3 結論

本研究通過MTT法檢測顯示：芹菜素的濃度對BCPAP細胞毒性有明顯劑量和時間依賴性；明場圖片表明芹菜素給藥組對BCPAP細胞形態和數目的影響明顯強于對照組，對照組的細胞數目多且細胞圓潤飽滿，芹菜素給藥組的細胞數目少且皺縮漂浮，表明芹菜素對BCPAP細胞生長有抑制作用；流式細胞儀檢測表明芹菜素給藥后，BCPAP細胞的細胞周期有明顯影響，使細胞周期阻滯在G2/M期，能加速誘導細胞發生程序性死亡。

綜上所述，芹菜素能抑制甲狀腺癌細胞的增殖和生長，其抑制機制可能使BCPAP細胞生長停滯在G2/M期并誘導細胞凋亡，其確切的抑癌機制還有待進一步的研究證實。

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