高效液相色譜法測定玉米中的游離酚和結合酚

李 艷 劉梅森 萬紅霞 孫海燕 從彥麗 許柏球 劉 冬

（華南理工大學輕工與食品學院1，廣州 510640）（深圳職業技術學院深圳市發酵精制檢測系統重點實驗室2，深圳 518055）（深圳市味奇生物科技有限公司3，深圳 518109）

高效液相色譜法測定玉米中的游離酚和結合酚

李 艷1，2劉梅森3萬紅霞2孫海燕2從彥麗2許柏球2劉 冬2

（華南理工大學輕工與食品學院1，廣州 510640）
（深圳職業技術學院深圳市發酵精制檢測系統重點實驗室2，深圳 518055）
（深圳市味奇生物科技有限公司3，深圳 518109）

建立了高效液相色譜法同時測定玉米中游離酚和結合酚的檢測方法，包括原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素、槲皮素。有機溶劑提取玉米中的游離酚，堿法提取玉米中的結合酚，以ZORBAX Eclipse Plus Phenyl－Hexyl（4.6 mm×250 mm，5μm）為分析柱，乙腈（A）和含0.4%乙酸的超純水（B）為流動相梯度洗脫，采用二極管陣列檢測器280 nm波長檢測。14種酚類化合物在一定濃度范圍內與其峰面積呈良好的線性關系，相關系數為0.999 4～0.999 9，加標回收率為90%～108%，相對標準偏差為0.03%～3.59%。試驗結果表明，該方法能用來同時測定玉米中的游離酚和結合酚。

玉米 游離酚 結合酚 高效液相色譜

玉米是世界上分布最廣泛的糧食作物之一，和小麥、水稻并列為世界三大糧食作物。因富含酚類化合物，玉米有預防心臟病、高血壓、癌癥等功效。多酚化合物是廣泛存在于自然界的一類含有多個酚羥基結構的化合物［1－2］，主要包括類黃酮、酚酸等物質［3］，具有抗氧化等能力［4－5］，能降低心血管疾病、癌癥的發病率，延緩衰老［6－9］。目前對于玉米的研究［10－13］主要集中于采用有機溶劑提取色素、黃酮等酚類化合物，再進行純化、結構鑒定和活性評價。然而，玉米等谷物中的酚類化合物通過氫鍵、疏水相互作用或共價鍵與蛋白質、糖類等結合，根據其結合程度由疏至密依次可分為游離型和結合型［14］。Sosulski等［15］建立了谷物可溶性游離多酚和不溶性結合多酚的分離提取方法。Liu［1］等用該方法比較了部分水果、蔬菜和谷物的多酚化合物含量結果表明，玉米中的酚類主要以結合形式存在，約占總酚的85%。采用有機溶劑提取大大低估了玉米的酚類含量及其生物活性，目前對于結合酚的組成研究甚少。為了準確評估玉米的酚類含量，有必要對玉米中游離酚和結合酚分別進行測定。本試驗對玉米中的游離酚和結合酚進行提取，建立了高效液相色譜法測定玉米中的游離酚和結合酚，并對建立的測定方法進行方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

SHIMADZU 20A高效液相色譜系統（DGU－20A3在線脫氣器、LC－20AT泵、SIL－20A自動進樣器、CTO－20A柱溫箱、SPD－M20A檢測器）：日本SHIMADZU；超純水機：美國Millipore；高速勻漿機：德國IKA；高速離心機：德國Eppendof；旋轉蒸發儀：德國Heidolph。

乙腈（色譜純）、乙酸（色譜純）、原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素、槲皮素：美國Sigma公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl－Hexyl（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫 30℃；流速1.0 mL／min；進樣量 20μL；檢測波長為 280 nm；流動相為乙腈（A）和含0.4%乙酸的超純水（B），梯度洗脫，0～5 min，3%A；5～10 min，3%～7%A；10～25 min，7%～10%A；25～30 min，10%～12%A；30～45 min，12%～15%A；45～50 min，15%A；50～70 min，15%～30%A；70～75 min，30%～3%A；75～80 min，3%A。

1.3 樣品前處理

1.3.1 游離酚提取

稱取2.0 g絕干樣品粉末于100 mL燒杯中，加入50 mL正己烷，冰浴10 000 r／min勻漿 10 min，3 000 g離心5 min。去除上清液。沉淀加入50 mL 80% 冰丙酮，冰浴10 000 r／min勻漿10 min。3 000 g離心5 min，取上清液。用80% 冰丙酮重復提取2次，合并上清液45℃旋轉蒸發蒸干。用80%甲醇溶液重溶，定容至10 mL，過0.45μm膜，待測。

1.3.2 結合酚提取

往沉淀里加入20 mL 2 mol／L NaOH，混勻，充滿N2室溫旋轉振蕩消化1 h。加4 mL濃HCl，混勻，放置2 min。再加入20 mL乙酸乙酯，搖勻，萃取5 min，3 000 r／min離心5 min，取上清液。下層液體再用乙酸乙酯萃取5次，合并上清液，45℃旋轉蒸發蒸干，用80% 甲醇溶液重溶，定容至10 mL，過0.45μm膜，待測。

2 結果和討論

2.1 色譜條件的選擇

酚類化合物含有酚羥基，流動相中加入適當比例的酸可以抑制酚羥基的電離，達到改善分離效果和修飾峰形的作用。本試驗考察了乙酸比例（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）對酚類化合物的分離效果及峰形的影響，試驗結果表明，當乙酸比例為0.10%～0.30%時，其分離度不佳，當乙酸比例增至0.40%時，其分離度及峰形均有明顯改善。故試驗最終選擇0.4%乙酸水溶液作為最佳流動相。

2.2 線性范圍、檢出限及定量限

在最佳的色譜條件下，測定不同濃度的酚類混合標準溶液，液相色譜圖見圖1，以峰面積（Y）為縱坐標，標準溶液的濃度（X，μg／mL）為橫坐標作圖，得到相應的回歸方程（見表1）。結果顯示14種酚類化合物分別在 1.33～42.80、12.56～402.00、1.33～42.40、1.93～61.60、1.29～41.20、0.76～24.40、1.46～46.80、4.75～152.00、0.53～16.88、0.88～28.00、8.00～128.00、3.86～123.60、2.70～43.20和3.20～51.60μg／mL范圍內具有良好的線性關系，相關系數在0.999 4和0.999 9之間。以3倍信噪比（S／N）測定14種酚類物質的檢出限（LOD），以10倍S／N計算定量下限（LOQ），結果見表1。

圖1 酚類化合物標準品液相色譜圖

表1 14種酚類化合物的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限及定量下限

2.3 精密度和穩定性

精密吸取混合標準溶液20μL，按照1.2色譜條件進行分析。重復進樣5次，測得原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素和槲皮素峰面積的 RSD分別為 1.16%、1.12%、1.28%、1.70%、1.35%、1.52%、1.35%、1.31%、1.35%、1.57%、0.87%、1.34%、0.78%和0.79%，結果表明該方法的精密度良好。

準確吸取玉米酚溶液20μL，于0、12和24 h分別進樣，測得原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素和槲皮素峰面積的相對標準偏差RSD分別為0.13%、0.67%、1.19%、0.21%、1.10%、0.51%、0.93%、0.51%、1.80%、1.66%、0.30%、0.93%、1.60%和2.39%，結果表明在24 h內樣品的穩定性良好。

2.4 回收率

精密吸取已知含量的同一樣品溶液9份，分成3組，每組以低、中、高3個標準加入混合標準溶液，按1.2色譜條件進行分析。原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素和槲皮素的回收率測定結果見表2。14種酚類成分的加標回收率為90%～108%，說明該方法具有良好的通用性。

表2 14種酚類化合物的加標回收率及相對標準偏差

2.5 再現性試驗

以黑玉米為研究對象，按1.3方法制備游離酚及結合酚，平行試驗3次，用1.2色譜法進行分析，測得游離酚中原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素和槲皮素峰面積的RSD分別為 0.04%、0.19%、0.01%、1.51%、0.17%、0.22%、0.17%、0.81%、0.30%、0.72%、0.89%、5.55%、0.95%和0.10%，結果表明該方法的再現性良好。

2.6 實際樣品的測定

選取白玉米、黃玉米和黑玉米為研究對象，按1.3方法制備游離酚及結合酚樣品，用1.2色譜法進行分析，結果見表3。

測定結果可知，以結合形式存在的阿魏酸是玉米中含量最高的酚類化合物，這與文獻［5］報道的阿魏酸是玉米中最主要的酚酸組分相符，與“以結合形式存在的阿魏酸占總阿魏酸的93%以上”也相符。

表3 樣品含量的測定結果／μg／mL

3 結論

HPLC法可用于定性定量分析玉米中的游離酚和結合酚，包括原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素、槲皮素。該法不僅具有快速簡便的優點，還有低檢出限定量限、高精密度、好穩定性及高回收率的優點。通過對玉米中游離酚和結合酚的測定可知，玉米中的酚類主要以結合酚形式存在，結合酚中主要為阿魏酸，可能以阿魏酸酯等形式存在于玉米中，下一步可采用HPLC－MS法確定玉米中酚類成分的結構。

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Determination of Soluble Phenolics and Bound Phenolics in Corn by High Performance Liquid Chromatography

Li Yan1，2Liu Meisen3Wan Hongxia2Sun Haiyan2Cong Yanli2Xu Baiqiu2Liu Dong2

（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology1，Guangzhou 510640）（Shenzhen Key Laboratory of Fermentation，Purification and Analysis，Shenzhen polytechnic2，Shenzhen 518055）（Shenzhen Weicky Biotech Co.，Ltd3，Shenzhen 518109）

An effective high performance liquid chromatographic（HPLC）method had been developed for the determination of soluble phenolics and bound phenolics，including protocatechuic acid.2.5－Dihydroxybenzoic acid，4－Hydroxybenzoic acid，chlorogenic acid，vanillic acid，caffeic acid，syringic acid，Epicatechin.coumalic acid，ferulic acid，sinapic acid，rutin，hesperetin and quercetin.Soluble phenolics were extracted with organic solvent；bound phenolics were extracted by alkaline.The separation and quantification of soluble phenolics and bound phenolics were achieved on ZORBAX Eclipse Plus Phenyl－Hexyl（4.6 mm×250 mm，5μm）with mobile phase of acetonitrile（A）and 0.4%acetic acid（B）with diode array detector（DAD）at 280 nm.The results indicated that the calibration curves of fourteen phenolics had expressed a satisfied linear relationships between peak areas and concentrations，with their correlation coefficients of 0.999 4～0.999 9，The average recoveries of fourteen phenolics were in the range of 90%～108%with relative standard deviations of 0.03%～3.59%，The method shall be suitable for determination of soluble phenolics and bound phenolics in corn.

corn，soluble phenols，bound phenols，high performance liquid chromatography（HPLC）

TS207.3

A

1003－0174（2015）09－0108－04

廣東省國際合作項目（2012B050600031），省部產學研結合項目 （2012B091100411），深圳職業技術學院青年創新項目（601422K27012）

2014－03－31

李艷，女，1982年出生，博士，活性成分功效研究

劉冬，男，1968年出生，教授，食品生物技術