米渣發泡蛋白的理化性質及形態結構

劉珊珊 陳季旺，2 陳 露 高 俊

（武漢輕工大學食品科學與工程學院1，武漢 430023）（農產品加工湖北省協同創新中心2，武漢 430023）

米渣發泡蛋白的理化性質及形態結構

劉珊珊1陳季旺1，2陳 露1高 俊1

（武漢輕工大學食品科學與工程學院1，武漢 430023）（農產品加工湖北省協同創新中心2，武漢 430023）

比較并分析了米渣蛋白（RDP）、脫酰胺米渣蛋白（RDDP）、米渣發泡蛋白（RDFP）的理化性質及形態結構。結果表明在pH 2～12，RDP的溶解度較低，RDDP的溶解度在pH 2～4.5減小，在pH 4.5～12則增加，RDFP的溶解度均高于90%。與RDP相比，RDDP與RDFP的起泡力在pH 8～10分別增加39%與126%以上，且在pH 9.5時分別達到最高值56%和196%。RDP的乳化性穩定，RDDP先減小后增大，RDFP則一直增大。RDDP與RDFP的必需氨基酸總量分別比RDP減少8.29%與7.7%，疏水值分別增加9.14%與30%。RDP、RDDP、RDFP均存在糖蛋白和α－螺旋、β－折疊片等二級結構，且數量依次減少。RDP結構緊密，聚集呈球狀，RDDP分裂為相對較小的塊狀聚集體，RDFP為大塊片層結構。RDFP具有良好的發泡性，可以作為一種蛋白質發泡粉用于食品工業。

米渣蛋白 脫酰胺米渣蛋白 米渣發泡蛋白 理化性質 形態結構

蛋白質發泡粉是改善食品起泡性、持泡性的輔料［1］，除具有其他發泡粉起泡、增白、乳化的作用，它還具有人體所需的氨基酸，提升了食品感官品質和營養價值［2］。目前國內對蛋白質發泡粉的年需求量為 4 000 t，但每年可提供量僅為 1 000 t［3］。蛋清蛋白和乳清蛋白等是蛋白質發泡粉的主要生產原料，但動物蛋白價格昂貴，生產成本高［4］，在應用中受到了一定的限制。米渣是大米制糖、發酵工業中的副產物，含有大米中的大部分蛋白質。我國每年加工大米1.3～1.4億t，其中，生產淀粉糖等會產生副產品米渣3 000多萬t。長期以來米渣僅作為飼料供給養殖業使用，其經濟價值未能充分利用，因此將廉價的米渣開發為一種性質優良的蛋白質發泡粉具有現實意義。

米渣中含蛋白質為35%～40%［5］，大米制糖過程中高溫液化引起的美拉德反應以及蛋白質中高含量的天冬酰胺和谷氨酰胺通過氫鍵等結合均會使蛋白質聚集、沉淀，導致其溶解度較低［6］，限制了米渣蛋白（Rice dreg protein，RDP）的開發利用。目前主要采用化學法［7－9］和生物酶法［10］對 RDP脫酰胺改性以增加其溶解性，使交聯的谷氨酰胺和天冬酰胺中的酰胺基轉變成羧酸，通過羧化作用減少分子內氫鍵，增加分子上的負電荷，增強靜電排斥作用，提高RDP的溶解度［6］。周小玲等［6］發現大米谷蛋白去酰胺度為52.29%時在中性溶液中溶解度高達96.99%。蛋白酶水解能提高RDP的起泡力和持泡力［11－12］，多種蛋白酶組合的復合酶水解能較大程度地使蛋白質分子的疏水性氨基酸暴露，從而提高蛋白質的發泡性［13］。Anderson等［14］用蛋白酶水解大米分離蛋白，發現蛋白質溶液表觀黏度顯著下降，發泡力和持泡力則增加。吳雨靜等［12］用中性蛋白酶水解脫脂脫糖米渣，制備出發泡性能良好的蛋白質發泡粉。潘敏堯［15］研究發現堿性蛋白酶水解RDP制得的蛋白質發泡粉的泡沫特性更好。本研究采用檸檬酸法對RDP脫酰胺制備脫酰胺米渣蛋白（RDDP）及復合酶水解RDDP制備米渣發泡蛋白（RDFP）的條件進行了優化。研究發現蛋白質的泡沫性能與表面疏水性［16］、分子形態結構［17］等緊密相關。

國內外有關米渣蛋白生產發泡粉的研究主要集中在如何提高米渣蛋白的溶解度［7－9］、乳化性［7－9］等，周小玲等［6］研究發現酶法脫酰胺影響了米谷蛋白的二級結構，但有關米渣蛋白的理化性質與形態結構關系的研究，目前還鮮見報道。本研究通過比較分析RDP、RDDP、RDFP的溶解性、發泡性、持泡性和乳化性等理化性質及形態結構，探討RDFP的理化性質與結構的關系，擬為利用RDP開發蛋白質發泡粉及RDFP在食品工業中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

米渣（蛋白質 59.04%、水分 11.88%、灰分2.64%、脂肪10.27%、糖16.17%）：合肥錦泰糖業有限公司；堿性蛋白酶（Alcalase，2.4 AU／g）、復合蛋白酶（Protamex，1.5 AU／g）：丹麥諾維信公司；高溫α－淀粉酶（α－Amylase，18 700 U／mL）：銳陽生物科技有限公司。

1.2 試驗儀器

SYC智能超級恒溫水浴鍋：鞏義市英峪予華儀器廠；LCJ.Ⅱ型離心機：上海醫用分析儀器廠；TGL－16C臺式離心機：上海安亭科學儀器廠制造；FD－1冷凍干燥機：天津儀器公司；LD5－10型離心機：北京醫用離心機廠；Delta320精密pH計：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；L－8900型氨基酸分析儀：日本日立公司；UV－2100紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；SX－40掃描電子顯微鏡：日本明石公司；紅外光譜儀（Nexus）：美國 Thermo Nicolet公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 制備RDP、RDDP和RDFP

米渣按料液比1∶10配成懸浮液，pH調至6.0，加入α－淀粉酶（加酶量 11.7 U／g），60℃水解2.5 h，80℃水洗3次，3 000 r／min離心，噴霧干燥制得RDP（蛋白質71.32%，可溶性氮3.23%，水分7.58%，灰分2.45%，脂肪4.39%，糖14.07%）。

取適量RDP置于酶解罐中，按料液比6∶100加入pH 1.5的檸檬酸溶液，80℃反應3 h，迅速冷卻反應液，4 000 r／min離心10 min，上清液經截留相對分子質量為3 000的膜超濾及噴霧干燥即得RDDP（蛋白質 80.92%，可溶性氮 29.74%，水分8.53%，灰分2.85%，脂肪2.13%，糖5.39%）；稱取0.5 g RDDP樣品，加5 mL 2 mol／L鹽酸，抽真空封于硬質玻璃管中，在115～125℃下水解3 h，水解完畢取出，待冷后打開玻璃管，20 g／L的硼酸吸收氮并測定酰胺氮含量，計算脫酰胺度（脫酰胺度58.49%）。

配制10%的RDDP溶液，將pH調至8.0，取適量置于酶解罐中，邊攪拌邊加入堿性蛋白酶（加酶量24 AU／kg），40℃反應100 min，加入同等體積的復合蛋白酶（加酶量15 AU／kg），40℃反應80 min，在反應過程中不斷加入酸或堿，維持pH 8.0±0.1，至反應結束。沸水浴20 min，滅酶，4 000 r／min離心15 min，得上清液即為RDFP（蛋白質84.15%，可溶性氮96.43%，水分7.63%，灰分2.28%，脂肪1.14%，糖4.72%）。

1.3.2 溶解度的測定

準確稱量1.000 g樣品溶于100 mL水中，在磁力攪拌器上以300 r／min的轉速攪拌，用1.0 mol／L HCl或NaOH迅速調至預定pH，攪拌30 min使樣品充分溶解。攪拌結束后4 000 r／min離心15 min，吸取上清液，采用半微量凱氏定氮法測定上清液中氮含量，計算溶出的蛋白質含量。分別測定RDP、RDDP、RDFP的溶解度，分析溶解度的變化。

1.3.3 起泡力及持泡力的測定

配制1%質量濃度蛋白溶液100 mL（V0），用2 000 r／min的速度攪拌10 min，停止攪拌并迅速倒入1 L量筒記錄液體和氣泡的總體積（V1），30 min后再次記錄溶液和氣泡的總體積（V2），起泡力、持泡力的計算見式（1）、式（2）。

1.3.4 乳化性的測定

配置5%蛋白質溶液15 mL，加入15 mL食用油，10 000 r／min均質1 min，移至50 mL帶刻度離心管中，于2 000 r／min的轉速下離心5min，測量離心管中液體的乳化層高度。乳化性計算見式（3）。

1.3.5 氨基酸組成的分析

準確稱取1.000 g樣品，移入玻璃試管中，加入15 mL 6 mol／L HCl，然后將試管抽真空充氮氣封管，放在108℃恒溫干燥箱內水解22 h，待冷卻后，定容至25 mL，吸取濾液100μL于40℃真空干燥器中進行干燥，用0.2 mol／L HCl定容至1 mL。采用氨基酸分析儀測定氨基酸含量。

1.3.6 疏水值的計算

根據各氨基酸的疏水值、RDP、RDDP、RDFP的氨基酸組成和含量，計算出RDP、RDDP、RDFP的平均疏水性值，計算公式見式（4）、式（5）。

式中：AAi為100 g蛋白質中每種氨基酸的質量／g；Mi為各種氨基酸的摩爾質量／g／mol；∑AAi／Mi為100 g蛋白質中氨基酸的總摩爾數／mol；Δfti為氨基酸側鏈疏水值／kJ／mol；Q為蛋白質的疏水值。

1.3.7 紅外光譜

用無水酒精將研缽、鑷子、壓片等用具擦試干凈，置紅外燈下照射以使酒精快速揮發干燥。在研缽中加入適量KBr粉末，按照約1∶10的比例分別加入RDP、RDDP、RDFP樣品，充分研磨混勻，壓片，壓片盡量薄而透明，以保證較高的透光率。用傅立葉變換紅外光譜儀測定紅外吸收光譜圖，以KBr粉末作為空白背景，設定分辨率4 cm－1，掃描次數為16次，全波長（4 000～500 cm－1）掃描。

1.3.8 掃描電子顯微鏡

對RDP、RDDP和RDFP進行干燥預處理，采用掃描電子顯微鏡觀察RDP、RDDP、RDFP的表面微觀形態。剪取適當大小靜電雙面膠置于掃描電鏡載物臺，挑取少量樣品均勻灑在雙面膠帶上，用洗耳球吹去多余的粉末。將電鏡載物臺放入鍍金器中進行高溫噴碳鍍金，設定電子槍加速為15 kV，掃描樣品表面結構，選擇合適的放大倍數掃描拍照。

2 結果與分析

2.1 溶解性

對RDP、RDDP和RDFP在 pH 2～12范圍內的溶解度進行測定，結果見圖1。由圖1可以看出，在pH 2～12范圍內，RDP的溶解度較小且隨pH變化不明顯，當pH大于10.0時，溶解度略有增加，這是因為RDP中的部分谷蛋白溶于堿性溶液；RDDP的溶解度隨著pH的增加先減小后增加，在pH 4.5左右達到最低值18.7%，可能是因為pH 4.5是大米谷蛋白的等電點，此時相對分子質量較大的谷蛋白發生聚沉；RDFP的溶解度高于90%且隨pH變化不大，說明RDFP具有較好溶解性，且受pH影響較小。在同一pH條件下，RDP、RDDP和RDFP的溶解度依次增加，RDDP的溶解度增加是RDP脫酰胺反應中酰胺鍵因羧化作用減少了分子內氫鍵，增加分子上的負電荷，增強了靜電排斥作用等［6］；RDFP的溶解度進一步提高可能是復合蛋白酶將部分RDDP降解成小分子寡肽。

圖1 RDP、RDDP和RDFP的溶解度

2.2 起泡力和持泡力

不同pH條件下RDP、RDDP和RDFP的起泡力和持泡力變化分別見圖2和圖3。由圖2和圖3可知，在pH 8～10范圍內，隨著pH的增大，RDP、RDDP和RDFP的起泡力逐漸增加，持泡力略有減小。與RDP相比，RDDP與RDFP的起泡力在pH 8～10范圍內分別增加39%與126%以上，且在pH 9.5時最高分別達到56%和196%，可能是pH既影響蛋白質的溶解度，同時又影響了蛋白質的柔性和表面疏水性，pH越大分子所帶靜電荷越多，起泡力增大［13］；在同一pH條件下，RDP、RDDP和RDFP的起泡力和持泡力均依次增高，可能與蛋白質的溶解度有關。蛋白質的起泡力是指蛋白質溶液形成氣－液界面薄膜并包容大量氣泡的能力。當一定濃度的蛋白質溶液受到急速攪拌時，氣泡混入形成大量的氣－液界面，吸附到界面的蛋白質分子降低了界面張力，進一步促進界面的形成，同時蛋白質肽鏈間的相互作用形成的二維網絡加強了界面膜，有利于泡沫的形成和穩定［13］，因此在pH 8～10范圍內，蛋白質溶解度越大起泡力和持泡力越大。

圖2 pH對RDP、RDDP、RDFP起泡力的影響

圖3 pH對RDP、RDDP、RDFP持泡力的影響

2.3 乳化性

不同pH條件下RDP、RDDP和RDFP的乳化性變化見圖4。由圖4可以看出，在pH 2～12范圍內，隨著pH增加，RDP的乳化性變化不明顯且均小于20%；RDDP的乳化性先減小后增大，在pH 4附近達到最低值37%；RDFP的乳化性則一直增加，當pH大于4時，RDFP乳化性最大。蛋白質乳化性取決于溶解度和疏水值［18］，結合圖1分析，pH 4.5是大米谷蛋白的等電點，其溶解度最小，因而RDP和RDDP的乳化性均在此時達到最低值。當pH＞4.5，蛋白質乳化性隨著pH的增加而增大，可能是脫酰胺作用使得大量基團（包括親水基團和疏水基團）暴露出來從而增加了蛋白質的溶解度和表面疏水性，使得蛋白質的親水性－疏水性達到乳化平衡從而提高其乳化性［19］。在相同pH條件下，RDFP的乳化性最好，這是因為在脫酰胺的基礎上進一步酶解蛋白，使得蛋白質空間結構發生變化，分子鏈被水解變短，親油性隨著油水界面可利用的寡肽含量增加而增加［19］，同時，蛋白質分子表面電荷數量增多，阻止了油滴的相互靠近，總體表現為乳化性提高。

圖4 pH對RDP、RDDP和RDFP乳化性的影響

2.4 氨基酸組成和疏水值

RDP、RDDP和RDFP的氨基酸組成、含量和疏水值見表1。由表1可以看出RDP、RDDP和RDFP的氨基酸含量略有不同。RDDP的必需氨基酸較RDP減少8.29%，RDFP較RDDP增加0.65%。與RDP相比，RDDP、RDFP的疏水性氨基酸含量分別增加0.21%和減少0.13%，疏水性氨基酸含量基本不變。RDP、RDDP和RDFP中，能夠賦予產品可口味道的香味氨基酸（包括天冬氨酸和谷氨酸）［20］含量均較高，其中RDFP中天冬氨酸和谷氨酸分別占11.7%和20.0%，這一特征使得RDFP更好的應用于食品工業。

RDP經脫酰胺、酶解，RDP、RDDP、RDFP的疏水值分別為 3.50、3.82、4.55 kJ／mol；與 RDP相比，RDDP、RDFP的疏水值分別增加9.14%與30.00%。這是因為脫酰胺和酶解破壞了蛋白分子致密的空間結構，包埋在分子內部的疏水基團部分暴露出來，引起蛋白質的疏水性增加。結合2.1、2.2和2.3分析結果發現，米渣蛋白的帶電氨基酸含量、疏水性及其溶解度均增加，可能是脫酰胺和酶解增加了蛋白質的表面電荷數量和疏水性，當蛋白質的親水性－疏水性達到乳化平衡時［21－22］，米渣蛋白發泡性能最佳。

表1 RDP、RDDP和RDFP的氨基酸組成、含量和疏水值

2.5 紅外光譜

利用傅里葉變換紅外光譜分析儀分析RDP、RDDP、RDFP的二級結構，結果見圖5。當蛋白質與糖分子通過共價結合后會出現羥基增加的典型特征，即在紅外圖譜的3 700～3 200 cm－1范圍內出現較寬的吸收峰，在1 260～1 000 cm－1范圍內也會出現吸收［23］。RDP的FTIR圖譜中有波數為3 293.83 cm－1和1 655.73 cm－1的糖環特征吸收峰，分別由糖分子內或分子間氫鍵及醛基、酰氨基團中的C==O伸縮振動或—NH2中的 N—H變角振動所引起［18］。另外，圖5中波數為1 079.43 cm－1的吸收峰是糖分子中C—O—C基團的伸縮振動引起，也是糖環存在的特征吸收峰。RDDP和 RDFP分別在3 415.40和3 385.23 cm－1有吸收峰，且強度略高于 RDP，表明RDDP和RDFP均存在糖分子內或分子間氫鍵；RDDP和RDFP分別在1 641.47和1 654.65 cm－1有吸收峰［24］，進一步說明糖環存在；RDDP、RDFP分別在1 048.10和1 047.26 cm－1有吸收峰，但各峰均弱于RDP，說明RDDP、RDFP中存在糖環基團但糖含量均低于RDP，因此脫酰胺和酶解作用在一定程度上破壞了糖與蛋白質的結合，降低了含糖量。米渣蛋白的溶解性增加伴隨著糖含量的減少，糖蛋白含量影響了米渣蛋白的溶解性。

根據表2對酰胺Ⅰ帶的譜峰進行分析，波數在1 650～1 658 cm－1范圍處為α－螺旋，在1 610～1 640 cm－1范圍處為β－折疊片，其中峰面積代表其含量；酰胺Ⅲ帶振動區域：1 290～1 340 cm－1為α－螺旋，1 255～1 288 cm－1范圍處為無規卷曲，1 181～1 248 cm－1范圍處為 β－折疊片［25］。圖 5中顯示RDP、RDDP和RDFP在1 650～1 658 cm－1范圍有強吸收峰、1 610～1 640 cm－1范圍無吸收峰、1 181～1 248 cm－1范圍有弱吸收峰，且RDP、RDDP和RDFP峰面積逐漸減小，表明檸檬酸脫酰胺和復合酶水解減少米渣蛋白的二級結構數量，α－螺旋、β－折疊片等二級結構數量的變化影響了米渣蛋白的理化性質。

表2 蛋白質酰胺的紅外吸收特征頻率表

圖5 RDP、RDDP和RDFP的傅里葉變紅外光譜

2.6 掃描電子顯微鏡

采用掃描電子顯微鏡觀察RDP、RDDP、RDFP的形態結構，結果見圖6。從圖6中可以看出，RDP結構緊密，形成聚集球狀（圖6a）；經過脫酰胺處理后球狀結構開始分裂形成相對較小的塊狀，仍部分保留有蛋白質分子聚集狀態（RDDP，圖6b）；RDDP經過復合酶組合酶解后聚集狀態徹底破壞，形成大塊片層結構（RDFP，圖 6c），這與 Miwa等［26］研究脫酰胺處理脫脂牛奶后蛋白質分子結構變化類似。蛋白質分子結構和聚集狀態的改變影響了RDP、RDDP和RDFP理化性質。

圖6 RDP、RDDP和RDFP的掃描電子顯微鏡外觀圖

3 結論

本研究比較了RDP和脫酰胺及2種蛋白酶分步水解制備的RDDP、RDFP的理化性質及形態結構，結果表明RDFP易溶，起泡力、持泡力高，乳化性強，帶電氨基酸含量及疏水性增加，可以作為一種良好的蛋白質發泡粉開發利用。FTIR和SEM試驗結果表明糖蛋白含量影響米渣蛋白的溶解性，檸檬酸脫酰胺和復合酶水解減少了米渣蛋白的α－螺旋、β－折疊片等二級結構數量，二級結構數量及形態的變化影響了RDP、RDDP和RDFP理化性質。

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Physicochemical Properties and Morpological Structure of Rice Dreg Foaming Protein

Liu Shanshan1Chen Jiwang1，2Chen Lu1Gao Jun1

（College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University1，Wuhan 430023）（Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products2，Wuhan 430023）

Physicochemical properties and morphological structure of rice dreg protein（RDP），rice dreg decarboxamidation protein（RDDP）and rice dreg foaming protein（RDFP）had been investigated.Solubility of RDP was low and stable at pH 2～12，solubility of RDDPdecreased at pH 2～4.5 then increased at pH 4.5～12 and solubility of RDFP was more than 90%.Compared to RDP，foaming force of RDDP and RDFP increased of more than 39%and 126%at pH 8～10 respectively and reached the maximum56%and 196%at pH 9.5 respectively.Emulsibility of RDP was stable and emulsibility of RDDPfirstly decreased and then increased，while that of RDFP increased.Total amount of essential amino acid of RDDP and RDFP decreased 8.29%and 7.7%respectively and the hydrophobicity increased 9.14%and 30%respectively.There was some glycoprotein and secondary structure for－helix and－strand in RDP，RDDP，and RDFP，meanwhile the quantity decreased successively.RDP presented closely as aggregate ball，RDDPbecame much smaller clumpy aggregations，and RDFPbecame a large piece of layer structure.The results indicated that RDFP might be used as a promising protein foam powder ingredient in food industry for its excellent physicochemical properties.

rice dreg protein，rice dreg decarboxamidation protein，rice dreg foaming protein，physicochemical properties，morphological structure

TS209

A

1003－0174（2015）04－0033－06

湖北省教育廳優秀中青年人才項目（Q20091808），武漢工業學院2001年研究生創新基金（2011CX012）

2013－12－19

劉珊珊，女，1988年出生，碩士，糧食、油脂及植物蛋白工程

陳季旺，男，1970年出生，教授，糧食、油脂及植物蛋白工程