熊貓豆提取物抑制腫瘤活性及誘導結腸癌細胞Caco－2凋亡機制研究

胡冬梅 彭呂楊 薛照輝

（天津大學化工學院食品科學系，天津 300072）

熊貓豆提取物抑制腫瘤活性及誘導結腸癌細胞Caco－2凋亡機制研究

胡冬梅 彭呂楊 薛照輝

（天津大學化工學院食品科學系，天津 300072）

為了探究熊貓豆的抑制腫瘤活性及其誘導Caco－2凋亡的機制，采用80%丙酮浸提法制備熊貓豆粗提物，通過MTT法測定其對人結腸癌細胞Caco－2增殖的抑制效果，瓊脂糖凝膠電泳、流式細胞術、酶聯免疫分析等技術與方法檢測細胞周期、DNA及凋亡相關蛋白相對表達量的變化。結果發現，與空白對照組相比，0.1～1.0 mg／mL熊貓豆丙酮提取物對Caco－2細胞增殖有明顯的抑制作用，且呈現劑量效應關系，IC50為0.72 mg／mL。0.4、0.6、0.8 mg／mL熊貓豆丙酮提取物處理72 h后的Caco－2細胞，可以觀察到典型的凋亡細胞的梯狀DNA條帶，細胞周期G1期延長，CytC、caspase－9、caspase－3蛋白的相對表達量均有顯著上升。熊貓豆丙酮能夠抑制結腸癌細胞Caco－2增殖，這種抑制作用是通過阻滯細胞周期和誘導線粒體通路介導的細胞凋亡實現的。

熊貓豆 人結腸癌細胞Caco－2 細胞凋亡 線粒體通路

結腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發病例約800萬人，占所有惡性腫瘤的10%～15%，死亡率僅次于肺癌和肝癌［1］。目前，結腸癌的治療方法仍以手術治療、放射治療和化學治療為主，但手術創傷性大、恢復時間長，在很大程度上限制其應用；放射治療和化學治療具有非特異性的細胞毒素作用，在殺傷腫瘤細胞的同時對機體正常組織器官也會造成一定程度的損傷，在應用方面仍存在爭議。食物治療因其成本低廉、方便無毒害等優點，日益成為防癌抗癌的研究熱點。因此，尋找一種對腫瘤細胞具有選擇性殺傷作用，且不傷害或者盡可能低的傷害正常細胞的食物成為當下結腸癌輔助治療的新方向。

大量試驗研究表明，水果、蔬菜及雜糧中含有大量的生物活性物質，能夠有效清除過剩的自由基，抑制癌細胞增殖，起到抗氧化和抗腫瘤的作用［2－3］，有助于預防由氧化損傷引起的癌癥、心血管疾病、糖尿病等慢性病的發生。據報道，在美國，有1／3的致死癌癥都可以通過合理的日常飲食而得到改善［4］。

熊貓豆是我國河西走廊的珍稀名貴彩色豆種。熊貓豆氨基酸種類齊全，人體不能合成的8種必需氨基酸中，除色氨酸和蛋氨酸含量稍低外，其余6種含量均較高，尤以賴氨酸含量豐富［5］。本研究以熊貓豆80%丙酮提取物為研究對象，以結腸癌細胞Caco－2為靶細胞，探究熊貓豆的抑制腫瘤活性及其誘導Caco－2凋亡的機制，旨在為將熊貓豆開發為功能食品、提升其附加價值提供一定的基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結腸癌細胞Caco－2：南開大學生命科學學院；熊貓豆：市售。

RPMI 1640培養基、Standard FBS、0.25%胰蛋白酶－EDTA消化液、MTT、RIPA細胞裂解液：北京索萊寶科技有限公司；DNA Ladder檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；人 caspase－3、caspase－9、CytC酶聯免疫分析試劑盒：Deco。

1.2 儀器設備

顯微鏡BX41：奧林巴斯；酶標儀Multiskan FC、CO2培養箱 HERcell 150i：Thermo；流式細胞儀FACSAriaIII：BD；穩壓穩流電泳儀 DYY－III2：北京六一儀器廠；紫外凝膠成像儀GIS－2009：上海天能有限公司。

1.3 熊貓豆提取物的制備

將熊貓豆碾碎成粉末，過60目篩，參照文獻［6］，取10 g樣品，與250 mL 80%預冷的丙酮混合，超聲助溶，攪拌 10 min，3 500 r／min離心 5 min，收集上清，重復1次，將2次上清收集，45℃旋轉蒸發至恒重后，冷凍干燥，儲存至－40℃待用。經稱量，熊貓豆丙酮提取物為0.125 g。

1.4 腫瘤細胞抑制試驗（MTT法）

人結腸癌細胞Caco－2培養于含有體積分數為10%FBS的RPMI－1640培養基內，置于37℃，5%CO2培養箱中。細胞生長至對數期用0.25%胰蛋白酶－EDTA消化傳代。

參照文獻［7］，取對數期細胞，調整細胞密度為1×105個／mL。將細胞懸液接種于 96孔板中，每孔100μL，置于CO2培養箱中培養6～8 h至其完全貼壁。小心地吸去原培養液，分別加入不同濃度的用完全培養基配制的樣品提取物（0.1～1.0 mg／mL）100μL，對照孔中加入100μL完全培養基，設置3個復孔，繼續培養72 h。棄去培養液，每孔中加入MTT（0.5 mg／mL）溶液，CO2培養箱中孵育4 h后，每孔中加入150μL二甲基亞砜，震蕩10 min使紫色結晶溶解，用酶標儀在570 nm測每孔的吸光度。按照以下公式計算細胞生長增殖率。

1.5 DNA ladder的檢測

調整細胞密度為2.5×105個／mL，接種于6孔板，每孔2 mL，將細胞置于CO2培養箱中培養至其貼壁，分別加入 0.4、0.6、0.8 mg／mL熊貓豆提取物200μL，以不含樣品的培養基作為空白對照，培養72 h后收集細胞。采用DNA Ladder檢測試劑盒，按照說明書的方法提取DNA。2%瓊脂糖凝膠電泳，5 V／cm，1 h，EB染色，紫外凝膠成像儀下觀察拍照。

1.6 流式細胞術檢測細胞周期

細胞培養和樣品處理方法如前面所述，72 h后收集細胞，按照細胞周期試劑盒說明，1 800 r／min離心5 min，棄上清；PBS洗滌細胞2次，1 800 r／min離心5 min，棄上清；加入5 mL 70%冰乙醇，混勻后－20℃固定過夜；2 200 r／min離心5 min棄上清，PBS洗滌。每管樣品加入0.5 mL PI染色液，混勻室溫避光反應30 min，1 h內上流式檢測。

1.7 CytC、caspase－9、caspase－3蛋白相對表達量的測定

CytC、caspase－9、caspase－3蛋白相對表達量利用Deco酶聯免疫檢測試劑盒測定。細胞培養方法和樣品處理方法同上所述。收集經熊貓豆提取物處理72 h后的Caco－2細胞，用RIPA細胞裂解液裂解細胞，收集總蛋白，參照試劑盒說明書進行Elisa操作，用酶標儀在450 nm波長處讀取吸光度。繪制標準曲線，并根據標準曲線計算處理后細胞內3種凋亡蛋白的相對表達量。

1.8 統計學分析

采用SPSS 18.0數據處理軟件進行統計學分析。單因素方差分析，兩兩比較采用Duncan檢驗，以P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 熊貓豆提取物對Caco－2增殖的抑制作用

由圖1可以看出，與空白對照組相比，在所選質量濃度范圍內（0.1～1.0 mg／mL），隨著熊貓豆提取物濃度的增加，結腸癌細胞Caco－2增殖率逐漸降低，且呈現明顯的劑量效應關系（P＜0.05）。當熊貓豆提取物質量濃度為1.0 mg／mL時，熊貓豆提取物對Caco－2細胞增殖的抑制率達到57.75%，IC50為0.72 mg／mL。因此選取 0.4、0.6和0.8 mg／mL 3個質量濃度進行后續細胞凋亡機制研究。

圖1 熊貓豆丙酮提取物對結腸癌細胞Caco－2的抑制作用

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

細胞凋亡時核酸內切酶被激活，選擇性降解染色質DNA，形成50～300 bp大片段，進而核小體連接處斷裂，形成180～200 bp或其整數倍的DNA片段，經過提取和純化后，通過瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色呈現出梯狀條帶（DNA Ladder），而正常細胞DNA由于其未被降解而只顯示總DNA一條特征條帶，以此判斷細胞凋亡的發生。

由圖2可以看出，未經處理的空白對照組細胞DNA，只顯示一條明亮的條帶，且由于其片段較大，遷移率低，因此停留在點樣孔附近。而經熊貓豆提取物誘導后的Caco－2細胞，其DNA發生不同程度的斷裂，電泳圖中呈現明顯的梯狀條帶，且DNA降解程度與熊貓豆濃度呈正相關，濃度越大，DNA降解程度越明顯。提示熊貓豆提取物可以誘導結腸癌細胞Caco－2凋亡。

圖2 熊貓豆丙酮提取物處理后Caco－2細胞DNA電泳圖譜

2.3 流式細胞術檢測細胞周期

PI，即碘化丙錠，可以與細胞內DNA和RNA結合，采用RNA抑制劑將RNA消化后，通過流式細胞術檢測到的與DNA結合的PI的熒光強度直接反映了細胞內DNA含量的多少。PI染色后，假設G0／G1期細胞的熒光強度為1，而含有雙份基因組DNA的G2／M期細胞的熒光強度的理論值為2，正在進行DNA復制的S期細胞的熒光強度為1～2之間。凋亡細胞由于細胞核發生濃縮以及DNA片段化導致部分基因組DNA片段在染色過程中丟失，因此凋亡細胞經PI染色后成明顯的弱染，熒光強度小于1，在流式檢測的熒光圖上出現Sub－G1峰，即凋亡峰。

圖3 熊貓豆丙酮提取物處理后Caco－2細胞周期圖

由圖3可以看出，Sub－G1峰所代表的凋亡峰所占比例隨熊貓豆作用濃度增大而增加。未經熊貓豆處理的空白組細胞，自然凋亡率為0.39%，而經熊貓豆提取物（0.4、0.6、0.8 mg／mL）作用后，凋亡程度明顯變大，其凋亡率分別為0.61%、1.08%、1.35%，呈現明顯的劑量－效應關系，且G1期所占比例隨著誘導物濃度的增加而增大，因此可以得出，經熊貓豆提取物處理后，細胞被阻滯在G1期，DNA復制延遲，誘導細胞凋亡。

2.4 CytC、caspase－9、caspase－3蛋白相對表達量的測定

由圖4可以看出，經熊貓豆提取物處理72 h后，凋亡蛋白CytC、caspase－9、caspase－3的相對表達量均有明顯提高，且在所選濃度范圍內，呈現劑量效應關系（P＜0.05）。未經誘導的空白對照組，CytC、caspase－9、caspase－3的表達量分別為（3.29±0.79）nmol／L、（0.01±0.00）ng／L和 （0.46±0.08）ng／mL，經熊貓豆提取物作用后，CytC的表達量分別提高了4.71、5.49、7.11倍，caspase－9的表達量分別提高了2.75、21、112.5倍，caspase－3的表達量分別提高2.26、5.34、8.13倍。

圖4 熊貓豆丙酮提取物處理后Caco－2細胞不同蛋白的相對表達量

3 討論

近年來大量研究表明，豆類中含有豐富的生物活性物質，經常食用豆類可以有效地降低結腸癌死亡的風險［8］。Dong等［9］研究結表明，黑豆皮丙酮提取物能夠抑制HepG2、MCF－7和Caco－2細胞的增殖。鐮形棘豆總黃酮對5種人癌細胞株也呈現不同程度的抑制效果，并存在劑量效應關系［10］。但這些研究僅限于豆類提取物抑制腫瘤的活性研究，對于如何抑制細胞增殖的機理并未闡述。本研究發現，當熊貓豆提取物質量濃度為0.72 mg／mL時，抑制率可以達到50%，說明熊貓豆對結腸癌細胞的增殖有良好的抑制作用。

許多化療藥物正是通過阻滯細胞周期進程或者誘導腫瘤細胞的凋亡發揮抗癌作用［11］。細胞周期主要分為G1、S、G2和M期4個階段，其中G1期持續時間變異很大，多數細胞的G1期較長，是細胞增殖的準備階段。不同誘導物對腫瘤細胞周期影響各異。山楂皮和果肉中的多酚提取物能夠抑制MCF－7細胞增殖，且細胞周期阻滯在S期［12］；柑橘通過阻滯G2期實現抑制肺癌細胞增殖［13］；本研究中，熊貓豆丙酮提取物誘導后的Caco－2細胞，G1期明顯延長，提示熊貓豆抑制結腸癌細胞Caco－2增殖可能是通過阻滯G1期引起的。

目前重建腫瘤細胞凋亡信號傳遞系統，即抑制腫瘤細胞生存基因的表達，激活死亡基因的表達成為治療癌癥的新思路［14］。線粒體通路是細胞凋亡的關鍵途徑，大量研究表明藥物可以通過線粒體通路誘導細胞凋亡［15－16］。熊貓豆丙酮提取物處理結腸癌細胞Caco－2 72 h后，存在于線粒體內、外膜之間的CytC，釋放到細胞質，引起caspase家族蛋白的級聯反應，從而激活核酸酶，誘導細胞凋亡。同時，核酸內切酶在誘導物作用下也特異性的從線粒體兩層膜間釋放，誘導DNA片段化，產生180～200 bp及其整數倍的DNA片段。CytC從線粒體釋放到胞漿是線粒體通路的關鍵步驟，隨著熊貓豆提取物濃度的增大，細胞質中CytC含量也逐漸增高，線粒體凋亡通路開啟。Caspase－9是線粒體凋亡通路的起始蛋白，是線粒體通路的標志。Caspase－3是線粒體通路的下游蛋白，是執行凋亡的重要效應因子［17］。本研究中，caspase－9和caspase－3蛋白相對表達量的升高表明，熊貓豆提取物誘導結腸癌細胞凋亡可能是通過線粒體通路實現的。

4 結論

熊貓豆丙酮提取物能夠抑制結腸癌細胞Caco－2的增殖，這種抑制效果可能是由于熊貓豆提取物能夠阻滯G1期，延長細胞周期，誘導由線粒體通路介導的細胞凋亡實現的。本結果為熊貓豆作為結腸癌輔助治療食品用于后續動物實驗及臨床治療提供了參考價值，也為其進一步開發利用提供了依據。

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Anti－Cancer Activity of Panda Bean Extract and Apoptosis－Inducing Mechanism Against Caco－2 Cells

Hu Dongmei Peng Lüyang Xue Zhaohui
（Department of Food Science，School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072）

In order to research the anti－cancer activity of panda bean extract and its mechanism of apoptosisinducing against Caco－2 cells，active compounds existed in panda bean have been extracted by 80%acetone aqueous solution.The inhibitory effect of panda bean extract against colon cancer cell Caco－2 with various concentrations was determined by MTT method.PI staining has been utilized to detect by cell cycle.Agarose gel electrophoresis has been utilized to detect cell apoptosis，and apoptosis－inducing mechanism was detected by ELISA.The results showed that compared with control group，0.1～1.0 mg／mL panda bean extracts expressed a significant inhibitory effect against Caco－2 with a dose－effect relationship and IC50was 0.72 mg／mL.After treated by panda bean extracts（0.4，0.6 and 0.8 mg／mL）for 72 h，typical apoptotic cell DNA ladder could be observed.Flow cytometry analysis showed that Caco－2 cell cycle could be arrested at G1 phase and sub－G1，which symbolized that the apoptosis cell was appeared after being exposed to panda bean extract.In addition，CytC，caspase－9 and caspase－3 protein levels were significantly increased.The results suggested that panda bean extract could induce apoptosis via mitochondrial pathway.

panda bean，human colon cancer cells Caco－2，apoptosis，mitochondrial pathway

R735.3

A

1003－0174（2015）04－0006－05

國家自然科學基金（31271979）

2013－12－06

胡冬梅，女，1989年出生，碩士，天然產物化學及功能食品

薛照輝，男，1973年出生，副教授，農副資源綜合利用、天然產物化學及功能食品