高溫高濕貯藏對(duì)玉米淀粉合成關(guān)鍵酶的影響

暢鵬飛 修 琳 鄭明珠 蔡 丹 劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130118）

高溫高濕貯藏對(duì)玉米淀粉合成關(guān)鍵酶的影響

暢鵬飛 修 琳 鄭明珠 蔡 丹 劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130118）

選用2013年收獲的“農(nóng)大709”玉米籽粒，根據(jù)吉林省夏季平均氣溫與相對(duì)濕度設(shè)定玉米的貯藏條件，將玉米籽粒分別貯藏于室溫和恒溫恒濕培養(yǎng)箱（35℃，75%）中，并測(cè)定分析了不同貯藏時(shí)間玉米籽粒可溶性淀粉合成酶（SSS）、束縛性淀粉合成酶（GBSS）、淀粉分支酶（SBE）以及淀粉脫支酶（DBE）活性的變化，進(jìn)而分析玉米在不同貯藏條件下淀粉品質(zhì)的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明：常溫條件下，只有SBE在貯藏第30天時(shí)有顯著的下降（P＜0.05），其余3種淀粉關(guān)鍵酶（SSS、GBSS、DBE）活性均沒有發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。高溫高濕貯藏條件下，SSS、SBE、DBE酶活性均呈極顯著下降（P＜0.01），且分別下降了42.1%、39.5%和33.7%。而GBSS酶活性則呈先上升后下降的趨勢(shì)（P＜0.01），較常溫貯藏，GBSS酶活性總體呈上升趨勢(shì)。

高溫高濕 可溶性淀粉合成酶 束縛性淀粉合成酶 淀粉分支酶 淀粉脫支酶

本試驗(yàn)選用“農(nóng)大709”玉米籽粒，通過人工模擬過夏貯藏條件對(duì)玉米籽粒進(jìn)行30 d的短期貯藏，對(duì)貯藏期間4種淀粉合成代謝關(guān)鍵酶活性的變化進(jìn)行了研究。通過對(duì)酶活性變化的分析，進(jìn)而推斷高溫高濕貯藏條件對(duì)玉米淀粉食用品質(zhì)的影響，以期為高溫貯藏條件對(duì)采后玉米食用品質(zhì)的影響提供參考。

1 材料及方法

1.1 樣品貯藏

選用“農(nóng)大709”作為試樣，測(cè)定初始水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.2%，將其用紗布包好，放入35℃，相對(duì)濕度為75%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，同時(shí)留一部分放在室溫下不控濕度，作為空白。貯藏期為30 d，每隔6 d進(jìn)行取樣。

1.2 試劑與設(shè)備

4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP－40）、二硫蘇糖醇（DTT）、2－（N－嗎啉）乙磺酸一水合物（MES）、支鏈淀粉（Amylopectin）、三甲基甘氨酸（Tricine）、腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、丙酮酸激酶（PK）、葡萄糖（Glucose）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）、己糖激酶（HK）：美國 sigma公司；可溶性淀粉：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；β－巰基乙醇：北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造公司；Z36HK高速冷凍離心機(jī)：德國Hermle Labortechnik GmbH公司；TU－1810紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 可溶性淀粉合成酶（SSS）和束縛性淀粉合成酶（GBSS）活性的測(cè)定

2.1.1 粗酶液的提取

參照程方民等［5］的方法，并略作改動(dòng)。

稱取3.0 g籽粒樣品，加12 mL提取緩沖液于4℃下浸泡12 h，冰浴磨成勻漿，取200μL勻漿加1.0 mL緩沖液，1 000 r／min 4℃離心 10 min，沉淀用緩沖液懸浮后用于GBSS活性測(cè)定，剩余勻漿10 000 r／min，4℃離心 30 min，收集上清液用于 SSS活性測(cè)定。

提取緩沖液：最終濃度為 Tricine－NaOH（pH 7.5）100 mmol／L，MgCL28 mmol／L，EDTA 2 mmol／L，甘油125 ml／L，PVP－40 10 g／L，β－巰基乙醇 50 mmol／L。

2.1.2 酶活性的測(cè)定

參照 Nakamura［6］等的方法，并略作改動(dòng)。

三十多年來，農(nóng)場(chǎng)培養(yǎng)了一個(gè)種植芒果的頂尖管理團(tuán)隊(duì)，一批批優(yōu)秀的芒果種植技術(shù)人才。他們憑借多年積累的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，讓優(yōu)質(zhì)芒果從林間樹梢來到人們的手中。

取240μL酶提取液加入36μL反應(yīng)液Ⅰ（其中包含 HEPES－NaOH（pH 7.5）50 mmol／L，ADPG 1.6 mmol／L，Amylopectin 0.7 mg，DTT 15 mmol／L），30℃反應(yīng)30 min后，沸水浴1 min終止反應(yīng)，冰浴中冷卻；加100μL反應(yīng)液Ⅱ（其中包含 HEPES－NaOH（pH 7.5）50 mmol／L，PEP 4 mmol／L，KCL 200 mmol／L，MgCL210 mmol／L，PK 1.2 U），30℃反應(yīng) 20 min后，沸水浴1 min終止反應(yīng)，10 000 r／min離心10 min。取上清液240μL與120μL反應(yīng)液Ⅲ（其中包含HEPES－NaOH（pH 7.5）50 mmol／L，Glucose 10 mmol／L，MgCL220 mmol／L，NADP 2 mmol／L，HK 1.4 U，G－6－PD 0.35 U），30℃反應(yīng) 20 min后，測(cè)定340 nm下OD值。以240μL煮沸的粗酶液作為對(duì)照，酶活性以每分鐘增加0.001 OD值為1個(gè)酶活單位［U·g－1（FW）·min－1］。

2.2 淀粉分支酶（SBE）活性的測(cè)定

2.2.1 粗酶液提取

參考Nakamura等［7］的方法，并略作修改。

取3 g玉米籽粒于研缽中，加入HEPES－NaOH，pH 7.5的提取緩沖液10 mL，4℃下浸泡12 h。冰浴條件下進(jìn)行研磨，所得勻漿于4℃，13 000 r／min離心15 min，取上清液裝于小清瓶中即為粗酶液，用于SBE酶活的測(cè)定。

提取緩沖液：50mmol／LHEPES－NaOH（pH 7.5），5 mmol／L EDTA，1 mmol／L DTT，2 mmol／L KCl，1%PVP－40。

2.2.2 酶活測(cè)定

酶活測(cè)定參照何煜［8］的方法，略作改動(dòng)。取250 μL粗酶液于試管中，加入1 500μL提取緩沖液，再加120μL 0.75%可溶性淀粉，混勻，在37℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min后，置于沸水浴中1 min終止反應(yīng)。加2 mL濃度為0.2%的鹽酸溶液，再加150μL碘液（0.1%I2—1%KI）顯色10 min后加2 ml蒸餾水進(jìn)行稀釋，測(cè)定波長(zhǎng)為660 nm處的吸光度值。以250μL滅活后的粗酶液作為對(duì)照。淀粉分支酶活性以波長(zhǎng)660 nm的吸光度值下降百分率表示，以每降低1‰碘藍(lán)值為1個(gè)酶活性單位［U·g－1（FW）·min－1］，所有測(cè)定均重復(fù)3次。

2.3 淀粉脫支酶（DBE）活性的測(cè)定

2.3.1 粗酶液提取

參考Nakamura等［7］的方法，并略作修改。

取貯藏玉米籽粒，稱取3 g于研缽中，加入MES－NaOH，pH 6.5的提取緩沖液10mL，浸泡12 h。冰浴條件下進(jìn)行研磨，所得勻漿于4℃，13 000 r／min離心30 min，取上清液裝于小清瓶中即為粗酶液。

提取液濃度：100 mmol／L MES－NaOH（pH 6.5），5mmol／LMgCl2，2 mmol／L EDTA，50 mmol／L，β－巰基乙醇和12.5%的甘油。

2.3.2 酶活測(cè)定

酶活測(cè)定參照文獻(xiàn)［9］，將每分鐘水解支鏈淀粉生成0.01 pmol的還原糖（以麥芽糖計(jì)）的酶量定義為 1個(gè)酶活力單位（pmol·min－1·μL－1）。

2.3.3 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)［9］。

2.4 數(shù)據(jù)分析

可溶性淀粉合成酶、束縛性淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉脫支酶活性變化規(guī)律使用Origin 8.5繪制，利用SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

3 結(jié)果分析

3.1 SSS活性變化趨勢(shì)

可溶性淀粉合成酶（SSS）是淀粉合成途徑中非常關(guān)鍵的淀粉酶之一，其主要負(fù)責(zé)支鏈淀粉的合成過程。由圖1所示，常溫貯藏過程中，SSS酶活性呈波動(dòng)變化，在貯藏第30天時(shí)，酶活性為0.148 8 U，較初始酶活性（0.151 4 U）有所下降。但是，據(jù)方差分析知，30 d的常溫貯藏過程中SSS活性變化不顯著（P＞0.05）。然而，高溫高濕貯藏條件下，SSS活性在貯藏第6天時(shí)就有顯著下降（P＜0.01），并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，下降趨勢(shì)更明顯。在貯藏第30天，SSS活性達(dá)到最低（0.087 6 U），較初始SSS活性下降了42.1%。由此可見，高溫高濕貯藏下，玉米籽粒中SSS活性發(fā)生了明顯的下降，這主要是因?yàn)镾SS為熱敏性淀粉酶［10］，其對(duì)溫度特別的敏感，當(dāng)外界溫度升高時(shí)，酶活性會(huì)發(fā)生明顯變化，Keeling等［10］稱此為“Knock－down”現(xiàn)象。

圖1 SSS活性隨貯藏時(shí)間的變化

3.2 束縛性淀粉合成酶（GBSS）活性的變化

GBSS是已發(fā)現(xiàn)的淀粉合成過程中又一種重要的酶類，在淀粉合成過程中，GBSS主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成［11］，還有報(bào)道稱，GBSS還能輔助支鏈淀粉的合成［12］。由圖2可知，常溫貯藏過程中，GBSS活性在第12天時(shí)出現(xiàn)最低值（0.587 U），但是通過方差分析可知，常溫貯藏過程中各貯藏時(shí)間GBSS活性沒有顯著的差異（P＞0.05）。在高溫高濕貯藏條件下，貯藏第6天時(shí)，GBSS活性沒有顯著變化。而貯藏第12天時(shí)，GBSS活性較初始值有明顯的上升（P＜0.01），達(dá)到峰值（0.624 U），隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，GBSS活性呈下降趨勢(shì)。30 d時(shí)的GBSS活性比初始（第0天）值上升了5.58%。圖2顯示，高溫高濕較常溫貯藏，GBSS活性總體升高（P＜0.05）。從而表明高溫高濕貯藏條件能夠加快玉米籽粒中底物轉(zhuǎn)化為直鏈淀粉的速度，這與Shi等［13］證明適當(dāng)?shù)臏囟瓤梢蕴岣吖任镏兄辨湹矸鄣谋壤邢嗨频慕Y(jié)果。

圖2 GBSS活性隨貯藏時(shí)間的變化

3.3 SBE活性變化

目前研究表明，SBE不僅能切開以α－1，4糖苷鍵連接的葡聚糖，并且能把切下的短鏈通過 α－1，6糖苷鍵連接于受體鏈上，形成分支的糖鏈，影響籽粒中淀粉的組成和結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶［14］。圖3顯示，2種貯藏對(duì)玉米中SBE活性的影響存在顯著差異（P＜0.05），并且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，SBE活性均發(fā)生了顯著的變化（P＜0.05）。常溫條件下，SBE活性呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，但是到第24天時(shí)，SBE活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異（P＞0.05），只有在貯藏第30天時(shí)有顯著下降（P＜0.05），出現(xiàn)了最低值（0.226 U），與貯藏第0天相比，第30天時(shí) SBE活性下降了5.91%。在高溫高濕貯藏條件下，SBE活性變化更加明顯，貯藏第6天時(shí)，SBE較第0天有所下降，但是變化不顯著（P＞0.05），而后SBE呈明顯下降趨勢(shì)。在貯藏末（第30天），SBE活性達(dá)到最低值（0.145 2 U），較初始酶活性下降了39.5%。從而可知，高溫高濕貯藏條件抑制了玉米籽粒中SBE的活性。

圖3 SBE活性隨貯藏時(shí)間的變化

3.4 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

利用origin繪圖軟件計(jì)算出麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k＝2.122 6，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 42?；貧w方程為：Y＝2.122 6X。

式中Y為麥芽糖含量，X為麥芽糖在540 nm處的吸光值。

3.5 DBE活性變化

早期研究表明，DBE在氨基酸序列上與α－淀粉酶相似，屬于淀粉水解酶家族。而Ball等［15］在提出了Glucan triming模型，認(rèn)為DBE在淀粉的合成中可以專一性地裂解支鏈淀粉上的α－1，6糖苷鍵，起到“修飾”淀粉結(jié)構(gòu)的作用。由圖4可知，常溫貯藏過程中，淀粉脫支酶（DBE）活性呈緩慢下降趨勢(shì)，但是根據(jù)顯著性分析得知，常溫貯藏30 d的過程中DBE活性變化不顯著（P＞0.05）。而高溫高濕條件下，DBE酶活性從貯藏第6天開始即發(fā)生了顯著變化（P＜0.05），而后呈不斷的下降趨勢(shì)。分析可知，高溫高濕條件下，貯藏第30天較第0天時(shí)DBE活性下降了33.7%。從而可知，高溫高濕貯藏條件加速了DBE酶活下降的速率。

圖4 DBE活性隨貯藏時(shí)間的變化

4 討論

在30 d的高溫高濕貯藏過程中，由于負(fù)責(zé)直鏈淀粉合成的GBSS活性的相對(duì)上升，可能會(huì)導(dǎo)致直鏈淀粉有所上升。Cheetham等［16］提出，直鏈淀粉擾亂了支鏈淀粉微晶的形成，直鏈淀粉會(huì)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，形成潛在的結(jié)晶排列。所以高溫高濕貯藏過程中，玉米淀粉更容易老化。此外，高溫高濕條件下支鏈淀粉合成有關(guān)酶（SSS、SBE、DBE）活性的下降，會(huì)導(dǎo)致支鏈淀粉含量會(huì)有所減少。從而分析得到，直鏈／支鏈淀粉比值會(huì)變大。所以，長(zhǎng)期的高溫高濕貯藏會(huì)導(dǎo)致玉米淀粉在體內(nèi)的消化率有所下降［17］，還有可能導(dǎo)致玉米淀粉的食用品質(zhì)劣變［18］。

5 結(jié)論

5.1 常溫貯藏下，除SBE活性發(fā)生了顯著的下降（P＜0.05）外，其余3種淀粉合成關(guān)鍵酶活性均沒有顯著的變化。

5.2 高溫高濕貯藏條件下，SSS、SBE和DBE活性分別下降了42.1%、39.5%和33.7%，而GBSS活性在高溫貯藏過程中總體呈上升趨勢(shì)。

［1］馮敏.中國玉米需求分析［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011

［2］Rehman Z U，Habib F，Zafar S I.Nutritional changes in maize during storage at three temperatures［J］.Food Chemistry，2002，77（2）：197－201

［3］張平，佀靜雪，王莉，等.采收成熟度對(duì)不同品種的玉米貯藏過程中碳水化合物含量的影響［J］.保鮮與加工，2012，12（5）：14－17

［4］王春輝，王清章，嚴(yán)守雷，等.氣調(diào)對(duì)甜玉米貯藏品質(zhì)的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（4）：2305－2307

［5］程方民，蔣德安，吳平，等.早釉稻籽粒灌漿過程中淀粉合成酶的變化及溫度效應(yīng)特征［J］.作物學(xué)報(bào)，2001，27（2）：202－206

［6］Nakamura Y，Yuki k.Changes in enzyme activities associated with carbohydrate metabolism duri－ng development of rice endosperm［J］.Plant Science，1992，82：15－20

［7］Nakamura Y，Umemoto T，Ogata N，et al.Starch debranching enzyme（R－enzyme or pullulanase）from developing rice endosperm：purification，cDNA and chromosomal localization of the gene［J］.Plant，1996，199：209－218

［8］何煜.鮮食玉米貯藏過程中SBE、DBE的活性變化規(guī)律研究［D］.長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013

［9］王浩，何煜，代立剛，等.鮮食玉米淀粉脫支酶活性測(cè)定方法的建立［J］.食品工業(yè)，2013（10）：166－169

［10］Keeling P L，Bacon P J，Holt D C.Elevated temperature reduces starch deposition in wheat endosperm by reducing the activity of soluble starch synthase［J］.Planta，1993，191（3）：342－348

［11］Denyer K，Johnson P，Zeeman S，et al.The control of amylose synthesis［J］.Journal of Plant Physiology，2001，158（4）：479－487

［12］Umemoto T，Nakamura Y，Ishikura N.Activity of starch synthase and the amylose content in rice endosperm［J］.Phytochemistry，1995，40（6）：1613－1616

［13］Shi Y C，Seib P A，Bernardin J E.Effects of temperature during grain－filling on starches from six wheat cultivars［J］.Cereal Chemistry，1994，71：369－383

［14］Mizuno K，Kimura K，Arai Y，et al.Starch branching enzymes from immature rice seeds［J］.Journal of Biochemistry，1992，112（5）：643－651

［15］Ball S，Guan H P，James M，etal.From glycogen to amylopectin：amodel for the biogenesis of the plant starch granule［J］.Cell，1996，86（3）：349－352

［16］Cheetham N W H，Tao L.Solid state NMR studies on the structural and conformational properties of naturalmaize starches［J］.Carbohydrate Polymers，1998，36（4）：285－292

［17］Englyst H N，Veenstra J，Hudson G J.Measurement of rapidly available glucose（RAG）in plant foods：a potential in vitro predictor of the glycaemic response［J］.British Journal of Nutrition，1996，75（3）：327－337

［18］Zeng M，Morris C F，Batey IL，et al.Sources of variation for starch gelatinization，pasting，and gelation properties in wheat［J］.Cereal Chemistry，1997，74（1）：63－71.

Effects of High Temperature and High Humidity Storage of Corn Grain on the Activity of Its Key Starch Synthases

Chang Pengfei Xiu Lin Zheng Mingzhu Cai Dan Liu Jingsheng
（Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，National Engineering Laboratory of the Wheat－corn Deep Processing，Changchun 130118）

Samples of corn grain“Nongda 709”gained in 2013 have been selected to study the effects of storage temperature and humidity on corn starch syntheses activity.The storage conditionswere set based on the average temperature and relative humidity in summer of Jilin Province.The corn grainswere stored in conditions at room temperature and the incubator（35℃，75%）respectively with constant temperature and humidity.The activity change of soluble starch syntheses（SSS），bound starch syntheses（GBSS），starch branching enzyme（SBE）and starch branching enzyme（DBE）of corn grainswith different storage timeweremeasured.Then the change of starch quality in different storage conditions was studied.The results showed that：on condition of normal temperature，only the SBE had significantly decrease（P＜0.05）on 30 d of storage.However，the activity of the other three kinds of key enzymes of starch synthesis（SSS，GBSS，DBE）were not significantly changed（P＞0.05）.On high temperature and humidity storage conditions，SSS，SBE，DBE enzyme activity were significantly decreased（P＜0.01），and decreased by 42.1%，39.5%and 42.1%respectively.However，GBSS activity first increased and then decreased（P＜0.01）.Compared with normal temperature storage，GBSS increased totally.

high temperature and high humidity，soluble starch syntheses，bound starch synthase，starch branching enzyme，starch branching enzyme

TS212.2

A

1003－0174（2015）11－0037－05

公益性行業(yè)（糧食）科研專項(xiàng)（201313011－3），玉米主食工業(yè)化生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化示范（2012BAD 37B05）

2014－04－28

暢鵬飛，男，1988年出生，碩士，糧油深加工與綜合利用

劉景圣，男，1964年出生，教授，糧食深加工