T細胞斑點試驗對結核性腦膜炎的診斷價值

李君蓮 李東軍 瑪力亞木·古麗比克 劉 艷 楊東奇（通訊作者）

1）新疆自治區胸科醫院檢驗科 烏魯木齊 830049 2）新疆烏魯木齊市紅十字急救中心 烏魯木齊 830091 3）新疆喀什地區結核病防治所 喀什 844000

結核性腦膜炎臨床癥狀特異性低，早期定性診斷較困難，結核菌素試驗（PPD）是結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染篩查和輔助診斷的經典方法，但其診斷特異性相對較低，多用于MTB 感染的篩查［1］。T 細胞免疫為基礎的體外γ-干擾素釋放試驗（interferon-γrelease assays）被證實在MTB 感染檢測中具有較好的特異性和敏感性［2］，其中以檢測外周血分泌γ-干擾素（IFN-γ）的T 淋巴細胞數量的T-SPOT．TB 試驗是使用最廣泛的一種。本研究檢測兩種技術診斷結核性腦膜炎的臨床價值，現報告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇我院2012-04—2013-11收治疑似結核性腦膜炎患者230例，男138例，女92例；平均年齡（43．2±8．8）歲。根據臨床癥狀、體征、影像學和（或）細菌學、病理學分等為將入選的患者劃分為確診、可能性大、診斷不明及排除診斷。

1．2 PPD 試驗 于患者的前臂掌側皮內注射結核菌素純蛋白衍化物（TB-PPD）（北京祥瑞生物制品有限公司生產）0．1 mL（5IU），觀察注射72h后的反應情況。參照《中國結核病防治規劃實施工作指南》（2008版）［3］評價標準，以硬結直徑≥10mm 為陽性結果。

1．3 T-SPOT．TB試驗 （1）8mL靜脈血枸櫞酸鈉抗凝，室溫保存（18～25℃），1600r／min離心28min；（2）用吸液管吸取白色、云霧狀的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）層轉移至15 mL 尖底離心管 中，加入細胞培養液至10mL 再600r／min離心7min，棄去上清液用1mL培養液重懸沉淀；（3）加培養液至10mL，350r／min離心7min；（4）棄去上清液加0．7mL培養液重懸沉淀，并孵育過夜；（5）分離的PBMCs放在包被INF-γ抗體的微孔板，加入結核特異性抗原早期分泌靶向抗原A（6-kDa early secreted antigenic target，ESAT-6）和培養濾過蛋白B（10-kDa culture filtrate protein，CFP-10），溫箱培養24h，洗去T 淋巴細胞，加入生物素標記的二抗，經酶聯顯色形成斑點，記錄斑點數［3］。根據抗原A 和（或）抗原B孔的反應判斷結果，滿足以下結果之一者為陽性：（1）如果陰性對照孔斑點數為0～5，則抗原A 或抗原B 斑點數-陰性對照孔斑點數≥6 者為陽性；（2）如果陰性對照孔斑點數≥6，則抗原A 或抗原B斑點數≥2×陰性對照孔斑點數為陽性［4］。

1．4 評價指標 檢測的靈敏性、特異性、陽性預測值和陰性預測值。

1．5 統計學分析 數據均采用SPSS 19．0 軟件包進行分析，計數資料采用McNemar檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

根據患者臨床表現、影像學、標本涂片抗酸染色及培養、組織病理學檢查等結果，確診結核53例，診斷為結核病可能性大的患者30例，排除活動性結核病診斷的患者121例，最終診斷不明的患者26例。排除診斷不明的26例患者，對診斷結核病的83例和排除結核病的121例患者進行檢驗，TSPOT．TB和PPD 的特異度率分別為98．3%和80．2%（χ2＝33．7，P＝0．0）；敏感度為95．2%和56．6%（χ2＝29．4，P＝0．0）。見表1、2。

表1 2種檢測方法在不同診斷患者中的檢測結果比較

表2 2種檢測方法各項統計指標比較

3 討論

快速、準確診斷活動性結核病對于有效控制結核至關重要。PPD、血清學檢查是目前最常用的結核病診斷手段，但特異性欠強，敏感性較低。其他方法還有涂片抗酸染色、結核分枝桿菌培養及組織病理學檢查等，但抗酸染色檢出率低，結核桿菌培養耗時較長，通常需要2個月，不利于早期診斷與治療，組織病理學檢查常為有創性，也不宜臨床普及。IFN-γ釋放試驗是近十年來開展臨床應用的一種診斷結核分枝桿菌感染的技術，其原理是機體受到MTB刺激會產生致敏的T 淋巴細胞，當再次遇到同類抗原時能細胞能產生IFN-γ，該實驗就是在體外以MTB 特異性的ESAT-6 和CFP-10作為抗原刺激細胞分泌IFN-γ，通過計數分泌IFN-γ的T 淋巴細胞數量，準確判斷機體是否存在結核感染。由于利用的是MTB的特異性抗原，與卡介苗或環境中大多數非結核分枝桿菌不存在抗原交叉，所以特異性大大高于PPD，且不會受到機體免疫狀態的影響［5］。

本研究對經傳統方法確診或排除的結核病患者分別進行T-SPOT．TB和PPD 檢測，結果表明T-SPOT．TB檢測診斷結核性疾病敏感度為95．2%，特異性為98．2%，顯著高于臨床常用的PPD，顯示出優異的診斷效能。而PPD 敏感度為56．6%，特異性為80．2% ，與文獻報道相似［6］，也因為其較低的準確度目前PPD 多用于篩查。

雖然T-SPOT．TB已經在世界各國和各大醫院廣泛使用，但應注意其不足之處：（1）該項技術需合適的儀器以及專門操作人員，技術難度遠高于PPD，同時標本的采集、運送、操作技巧均可影響其精確度。（2）試劑盒花費較高，難以在結核病流行的國家和地區推廣，批量化生產仍需進一步的努力；（3）T-SPOT．TB只能用于檢測機體是否有結核感染［7］。

［1］中華醫學會結核病學分會．肺結核診斷和治療指南［J］．中華結核和呼吸雜志，2001，24（2）：70-74．

［2］Lui G，Lee N，Cheung SW，et al．Interferon gamma release assay for differentiating tuberculosis among pneumonia cases in acute healthcare setting［J］．J Infect，2011，62（6）：440-447．

［3］張瑛，孫亞蒙，徐欣暉，等．結核感染T 細胞斑點試驗在結核性疾病中的診斷價值［J］．中華臨床醫師雜志（電子版），2010，4（12）：2 431-2 434．

［4］張立華，靳文香，賈紅彥，等．T-SPOT 與結核菌素試驗對結核病患者的臨床診斷價值［J］．中華臨床醫師雜志（電子版），2012，6（14）：4 107-4 108．

［5］Kim SH，Song KH，Choi SJ，et al．Diagnostic usefulness of a T cell-based assay for extra pulmonary tuberculosis in immune compromised patients［J］．Am J Med，2009，122（2）：189-195．

［6］Talbot EA，Harland D，Wieland-Alter W，et al．Specificity of the tuberculin skin test and the T-SPOT．TB assay among students in a low-tuberculosis incidence setting［J］．J Am Coll Health，2012，60（1）：94-96．

［7］Sztajnbok FR，Boecha NL，Sztajnbok DC，et al．The challenge of pediatric tuberculosis in face of new diagnostic techniques［J］．J Pediatr（Rio J），2009，85（3）：183-193．