蘭花遠緣雜交與多倍體育種研究進展

李海燕，郭瑩，李夏媛，李枝林

(云南農業大學花卉研究所，云南昆明 650201)

目前，蘭花的育種仍是以雜交育種為主，隨著生物技術的發展，多倍體育種具有其他育種方式不可代替的優勢。將蘭花遠緣雜交育種與多倍體育種相結合，不僅可以克服遠緣雜交不親和性，而且可以育成觀賞性狀更好的蘭花新品種。蘭花是蘭科植物(Orchidaceae)的總稱，我國習慣上將蘭花分為國蘭和洋蘭［1］。國蘭主要指人們常說的春蘭、蕙蘭、建蘭、寒蘭、墨蘭這5大類，因其株型秀麗、葉姿態飄逸、花色素雅、花香清幽而深受國人的喜愛;洋蘭大多數是指那些花序大、花瓣平整寬大，花型豐滿圓潤、花色鮮艷的種類，如蝴蝶蘭、石斛、兜蘭、卡特蘭、大花蕙蘭等。國蘭和洋蘭各自具有良好的觀賞性狀，如何通過雜交育種方法，選擇、選配父母本培育出受市場青睞的具有更多優良性狀的蘭花新品種，是國內外蘭花育種工作者為之不懈奮斗的目標。筆者對用多倍體育種克服遠緣雜交不親和性，結合組織培養方法獲得性狀優良的蘭花新品種的方法進行闡述，以期為今后蘭花雜交育種提供依據。

1 蘭花遠緣雜交育種的歷史

我國栽培蘭花的歷史已有2 000多年，但是雜交育種工作開展卻很少。在自然狀態下蘭花雜交僅限于屬內，主要有以下原因:①許多蘭花以特定的昆蟲為其傳粉;②不同種類蘭花花期不同;③由于地理分布的阻礙及雜交不親和性。在蘭花遠緣雜交工作中，若能解決遠緣雜交不親和性，那么通過人工授粉來進行蘭花雜交育種則可使雜交后代出現的可能性大大增加。我國蘭屬植物的雜交育種起始較晚，在國際上登錄的雜交種寥寥無幾［2］。可能受傳統文化的影響，要遵從萬物自然生長的規律，不能人為干擾，所以長期以來幾乎一直沒有人用人工雜交育種來生產新的雜交品種。1992年，美國植物生理學家發現糖類能代替真菌提供蘭花種子萌發所需的營養物質，在無菌條件下將蘭花種子播種于含糖的培養基上就能正常萌發［3］。此后，蘭花品種間、種間及屬間的雜交育種得以開展。

2 蘭花遠緣雜交育種和多倍體育種取得的成就

據《國際散氏蘭花種雜種登記目錄》(Sarder’s List of Orchid Hybrids)記載，人工雜種約在4萬種以上，而且還以每年1 000種以上的速度增加，僅遠緣雜交就育成由7個屬雜交產生的集體雜種［4］。張志勝等從1996年開始進行蘭花遠緣雜交的試驗研究來改良墨蘭的性狀，蘭屬內雜交組合有下山墨蘭 ×大花蕙蘭(Cymbidium grandiflorium Ldl．)、寒蘭 × 建蘭、墨蘭×建蘭、企劍白墨×春蘭;屬間雜交組合有墨蘭×文心蘭(Oncidium flexuosum L．)和墨蘭 × 蝴蝶蘭［5］。曾宋軍等用仙殿墨蘭自交及其與象白牙或西藏虎頭蘭雜交，育成2個新品種，其花色美觀，在生長勢和抗逆性等方面均優于親本，現已進行大規模推廣［6］。麥奮用我國傳統春蘭品種‘翠蓋’與垂花型雜交蕙蘭成功培育出具有雙親半數特征的新品種［7］。李方等通過蕙蘭×臺蘭種間雜交獲得中間型開花的植株［8］。朱根發等曾報道獲得了建蘭×蓮瓣蘭(C．aloifolium)雜交后代［9］。李枝林等選擇蘭屬、蝴蝶蘭屬、貝母蘭屬、鶴頂蘭屬、壇花蘭屬、兜蘭屬、槽舌蘭屬作為屬間雜交親本;以蘭屬的6個種碧玉蘭、沉香虎頭蘭黃素、蓮瓣蘭和大雪蘭作為種間雜交親本，獲得了一批雜交種子［10］。同時，對大花蕙蘭×虎雪蘭和春綠蘭×虎雪蘭的F1代進行多倍體誘導，獲得了異源多倍體植株。

深受人們喜愛的紅花系大花蕙蘭均為雜交種，染色體倍性呈多樣性，有二倍體、三倍體、四倍體、甚至六倍體，以它們作為親本與其他蘭花進行雜交，育成了多種在國際上獲得獎項的新品種。近年來，美國、日本和新西蘭等國的育種者將大花蕙蘭與建蘭、紋瓣蘭等雜交，培育出了一些早花(秋冬開花)、微香、短葉型或垂花型大花蕙蘭品種，很受市場歡迎［11］。

3 蘭花遠緣雜交與多倍體育種方法

3．1 蘭花雜交育種方法

3．1．1 建立蘭花種質資源圃。我國野生蘭花資源極其豐富，約有173屬1 200多種蘭花原生種。建立蘭花種質資源圃，首先要對野生蘭花的生境及種類進行調查，模擬蘭花生境自然條件，盡可能搜集不同的蘭花原生種進行試驗種植，觀察并記錄它們的各個性狀(如株高、葉型、花色、花香、花朵數量等)以及抗逆性、適應性、生育期、性狀遺傳規律、對環境條件的要求等，確定蘭花雜交親本組合親本的選擇。

3．1．2 親本選擇。良好的觀賞性是進行蘭花雜交育種的首要目標，其次是提高抗性。人們趨向于培育出花大色艷、有香味的新品種。可以結合國蘭和洋蘭各自的優點來進行親本的選擇，如國蘭中的墨蘭葉型漂亮、葉幅寬有光澤，但香味不足;蕙蘭香氣濃、抗逆性強，但開花時間晚且不易開花;建蘭最易上花，香氣也足，但開花時間短，集中在夏秋兩季。大多數的洋蘭品種雖花大、色艷，1個花序上著花較多，但無香味。在進行父母本選擇時，針對已有的原種優缺點擬定合適的組合進行雜交。

3．2 多倍體誘導方法 人工誘導多倍體的途徑主要有物理方法、化學方法和2n配子法。①物理方法主要是用溫度驟變、機械創傷、電離射線和非電離射線處理等方法進行染色體加倍［12］。早期誘導多倍體大多采用摘心和高低溫處理授粉后的幼胚等機械方法［13］。經過高溫處理可以誘導楊樹的二倍體花粉［14］，但總的來看溫度驟變和機械創傷是染色體加倍的頻率很低，而射線在使染色體加倍的同時又會引起基因突變，因此運用物理方法多不理想。②化學方法是利用一些化學誘變劑，如秋水仙素、萘嵌戊烷和富民農等。在蘭花多倍體誘導過程中大多是用秋水仙素，一般濃度在0．01% ～1．00%，以0．20%最為常用。通常是誘導的方法有浸漬法、涂抹法、滴液法、套罩法、毛細管法和復合處理等方法。蘭花多倍體的誘導大多采用浸漬法和混培法，將蘭花的原球莖、叢生芽或幼苗浸泡在不同濃度的秋水仙素溶液中，然后轉入培養基進行培養，或者將誘導材料接入含有不同濃度的秋水仙素溶液里培養。在用秋水仙素進行處理時，必須要注意藥劑濃度、處理時間、細胞分裂時期和植物生長狀況。孟英用濃度3%的秋水仙素處理大花蕙蘭×虎雪蘭的原球莖72 h，多倍體誘導率達30%。由于秋水仙素是一種較強的神經性毒劑，對人、畜危害極大。近年來，發現一些除草劑(如Oryzalin、Sufflan、Trifulan等)，這些藥劑是一類安全、高效的植物染色體加倍劑，因為這些藥劑對植物的微管蛋白的親和性高，同時對動物蛋白的親和性低［15］。其中，Oryzalin能阻止正在分裂中的細胞紡錘絲形成，在藥效消失后細胞又恢復常態，重新分裂而形成多倍體，對植株的危害小，但目前在國內尚未見到使用Oryzalin誘導蘭花多倍體的報道。③利用2n配子法獲得多倍體。用秋水仙素等化學誘變劑誘導的多倍體只能將原有類型染色體數增加1倍，誘變后都是偶數倍的多倍體。通過有性雜交，親本形成配子之前染色體數目不減半，而是形成2n配子，與正常配子受精可以產生同源多倍體，繼而產生一系列非整倍體。Watanabe用抗病馬鈴薯2n配子與易感病的四倍體雜交，并獲得了抗病的四倍體后代。同時，通過2n配子和正常二倍體雜交可以直接得到三倍體，而不需要四倍體親本。在自然界多倍體形成的主要途徑是利用2n配子，而目前在人工多倍體誘導中很少采用，現已較為深入地研究和應用2n雄配子，而2n雌配子相對較少。可以效仿天然多倍體的形成途徑，利用2n配子進行生物多倍體育種，2n配子的雜合性和二倍性，使其在生物多倍體育種上極具意義，對2n配子產生條件和遺傳控制機制進行深入研究，選擇高產2n配子的生物個體應用到育種中，必將推動多倍體育種工作的發展［16］。

遠緣雜交是獲得新種的重要因素，利用遠緣雜交方式可以將更多雙親的優良性狀集中在雜交后代，獲得的雜種后代通常具有雜種優勢。但是，由于2個親本的形態特征、遺傳組成和細胞結構等方面不同常常導致雜種F1代細胞在減數分裂時不能進行正常聯會而不育。通過對親本之一進行染色體加倍成同源多倍體或者對雜交雙親同時加倍，來克服雜交不孕性。例如，二倍體甘藍與白菜不易雜交成功，但四倍體甘藍則能與之雜交。此外，也可以對F1代進行染色體組加倍，使其細胞在減數分裂時能正常聯會，來克服遠緣雜種的不育性。

在進行蘭花新品種選育過程中，多倍體育種的意義還表現為通過染色體加倍的植物表現出的“巨大性”，可以培育出花朵大、花瓣多且厚、花色濃的蘭花新品種。此外，多倍體蘭花的植株粗壯、葉片寬闊濃綠，進一步提高蘭花的觀賞價值和商品價值［17］。多倍體植株對外界環境條件的適應性更強，抗旱、抗寒能力也進一步提高。也可以將多倍體作為基因轉移的載體和基因漸滲的媒介作用，將野生種中的抗病基因轉移到栽培種。

4 存在問題

蘭花雜交育種是一個系統的過程，周期長達7～8年，在制定育種目標時要判斷在7～8年后是否能得到消費市場的認可;雜交后代性狀分離，分離的后代中雜種類型較多，要注意篩選;雜交種子的無菌萌發是進行雜交育種的關鍵環節，要選擇合適的培養基，同時注意激素的配比。在多倍體誘導過程中，往往會出現大量的嵌合體，由于蘭花生長緩慢，對嵌合體的純化非常困難;多倍體植株染色體數目增多，細胞分裂速度慢［18－19］，而且多倍體植株還存在組織培養中增殖率極低和花期延遲等問題需要解決;誘導蘭花多倍體使用的秋水仙素等化學誘變劑對蘭花都有不同程度毒害作用，處理濃度和時間不適宜會抑制植株生長，甚至會導致植株死亡。在自然界中的異源多倍體能較好地保持性狀生存下來，而人工誘導的異源多倍體通常競爭不過正常二倍體或者又變回二倍體，因此異源多倍體的遺傳機制還有待深入研究。

5 展望

經過2個或2個以上物種的染色體經過重組后而形成的遺傳穩定結構的個體叫做異源多倍體［20］。開展種屬間雜交結合染色體加倍而形成的異源多倍體不僅可以克服遠緣雜交的育種障礙，而且合成了一個新物種，在蘭花新品種培育方面具有廣闊的前景［21］。在異源多倍體中，雜合子往往還具有潛在的雜種優勢。在水稻的研究中，遠緣雜交和多倍體化相結合的育種技術不僅理論上已經完善，以野生稻為重點的稻屬11個基因組圖譜也在研究中［22－23］。然而，我國對蘭花異源多倍體的系統研究尚未有報道。異源多倍體的基因表達的變化豐富了生物的多樣性，常出現不同于其二倍體且不能用孟德爾定律解釋的新表型［24－26］，這些變異為育種工作提供了豐富的資源，對品種改良具有重要意義。此外，異源多倍體在形成早期，基因組會經歷一個較長時間的穩定性進化過程，親本染色體間存在部分同源性會引起親本染色體組間發生廣泛的重組交換［27］，從而使異源多倍體不同世代產生的配子間出現差異。因此，在利用遠緣雜交與多倍體育種時還應充分考慮和研究不同世代的利用效果。我國目前雖有育成異源多倍體蘭花植株，但關于異源多倍體蘭花的性狀、基因表達模式及其原因還未見報道，這將是今后在進行蘭花新品種選育過程中的主要研究方向之一。

在保護的前提下，充分利用野生蘭花資源，克服蘭花雜交育種過程中遇到的種種技術難題，將蘭花遠緣雜交與多倍體育種相結合將是今后蘭花育種的熱點之一。將蘭花常規雜交育種方法和誘變育種、基因工程相結合，以組織培養為手段，培育出觀賞性好、抗性強的蘭花新品種，滿足市場的需求，必將使我國蘭花在競爭激烈的國際市場中立于不敗之地。

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