SSR標記技術及其在楊梅上的應用

張紹陽，姚 永，羅 靜，徐昌杰(．銅仁學院生物與農林工程學院梵凈山特色動植物資源重點實驗室，貴州銅仁554300;2．浙江大學果實品質生物學實驗室/浙江省園藝植物整合生物學研究與應用重點實驗室，浙江杭州30058)

簡單重復序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，又稱為微衛星DNA(Microsatellite DNA)，是在生物基因組中由1～6個核苷酸組成的基本序列單元(或基序)多次重復串聯構成的DNA序列，序列長度一般不超過200 bp［1］。SSR標記技術可用于果樹種質資源遺傳多樣性、進化與分類、品種鑒定、同物異名和同名異物品種的鑒別、無性系和體細胞突變的鑒別、DNA指紋圖譜構建、種質資源保存和利用以及分子遺傳連鎖圖譜構建等研究，是目前果樹遺傳育種研究廣泛應用的一種DNA分子標記技術［2-4］。

楊梅(2n=16)，又名朱紅、樹莓或龍晴，亞熱帶常綠喬木或灌木雌雄異株果樹，為楊梅科(Myricaceae)楊梅屬(Myrica L．)植物［5］;在我國，本屬植物有 6 種和 5 個變種(變型)，栽培楊梅品種有305個，品系為120個，均屬于楊梅(M．rubra)種［6-7］。楊梅是我國南方地區特色水果［7］，其果實于5月底～7月初成熟，成熟果實色澤鮮艷，柔嫩多汁，風味獨特，果實含鉀量高，具有較高的營養和醫療保健價值［8-10］。楊梅具有較高的栽培經濟價值，現為浙江省第二大果樹經濟作物(僅次于柑橘)。

自2006年日本學者Terakawa等［11］報道楊梅SSR標記研究以來，近年來陸續有楊梅SSR標記相關研究的報道，這些研究很好地推進了楊梅種質資源研究工作。基于此，筆者先對SSR標記主要技術特性進行概述，再對SSR標記技術在楊梅上的應用進行綜述，以期為相關研究提供參考。

1 SSR標記技術概述

1．1 SSR位點的類型及其特征 SSR位點廣泛分布于植物基因組的不同位置，SSR位點不僅數量眾多，而且也存在各種類型。在植物全基因組上，SSR位點數量可達104～105，廣泛存在于基因組的各個區域，每隔10～50 kb就有1個SSR位點存在，SSR重復單位的堿基組成和重復次數因物種而異［2-3］。

依據重復單元(或基序)堿基個數不同，SSR可分為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸等重復類型。對于上述幾種類型的SSR在全基因組上的構成，不同植物其構成也不盡相同。據報道，單核苷酸SSR在所有植物全基因組上數量最多(而且都是以A/T重復SSR為主)，五和六堿基核苷酸SSR明顯少于其他類型的SSR;各種類型的SSR頻率(即在全基因組上總體數量)隨著重復次數增加而逐漸降低［12-14］。在葡萄和蘋果上，二核苷酸SSR數量僅次于單核苷酸SSR，且AT/TA重復的SSR占該類型SSR總量的30%以上，三核苷酸SSR同單核苷酸SSR與二核苷酸SSR一起構成該類型植物基因組SSR的主體［12-13］;在擬南芥、水稻、大豆、玉米、高粱、苜蓿和楊樹等植物上，單核苷酸至四核苷酸4種重復類型SSR占此幾種植物全基因組SSR的絕大多數，其他類型SSR僅為總SSR的10%左右［14］。在葡萄上，SSR主要分布在基因間隔區，其次在基因的非翻譯區，基因編碼區SSR密度最小;三核苷酸SSR和六核苷酸SSR比其他SSR在編碼區豐度要高，分別為19個/Mb和10個/Mb;數量豐富且易突變的二核苷酸SSR是開發SSR標記的重要來源［12］。

依據重復序列長度，Temnykh等［15］將SSR分為兩類，第一類為ClassⅠSSR(高度可變類型)，其重復序列長度不低于20 bp;第二類為ClassⅡSSR(潛在可變類型)，其重復序列長度處于10～20 bp。依據核心序列排列方式不同，SSR可分為完全型、不完全型和復合型3種類型。完全型SSR的核心序列以不間斷的重復方式首尾相連，目前研究的SSR大多屬于此類;不完全型SSR的核心序列在非末端有不多于3個非重復堿基;復合型SSR，是指由2個或2個以上的核心序列串聯組成的DNA片段，基本單元序列相同的2個核心序列之間要有不少于3個的非重復堿基［16］。后2種類型SSR在植物基因組中也占有一定比例，但目前此2種SSR標記研究很少。依據所在位點序列的來源，SSR也有3種類型:來源于各種基因組DNA序列的普通SSR(即genomic SSR)，來自于各基因編碼區序列的EST-SSR(又可稱為cDNA-SSR，cSSR或genic SSR)，以及來源自于細胞核外DNA序列的核外SSR(如葉綠體SSR和線粒體SSR等)。

1．2 SSR的遺傳特性 起初，SSR序列被認為是一類垃圾DNA序列，不轉錄也不發揮生理調控功能。后來發現SSR在基因組上并不是隨機分布的，一般基因間隔區DNA序列中SSR豐度比轉錄區高;在轉錄調控區、5'UTR(Untranslated regions，非翻譯區)區、編碼區和3'UTR區，SSR豐度呈依次下降趨勢;SSR序列也有其特定的生物功能，如編碼區SSR可導致蛋白質種類和功能改變，轉錄調控區SSR能影響基因轉錄效率，位于UTR的SSR位點長度可影響下游基因的翻譯效率等［17-19］。不同生物種類SSR構成具有一定的特異性，SSR序列(包括基序種類和重復數大小)隨著基因組位點不同而異，同一位點不同基因型生物個體SSR重復序列大小也可能有很大差異，SSR序列這種高度變異性就是SSR序列相關DNA標記技術產生DNA片段長度多態性的分子基礎［20］。一般認為，單個SSR位點在不同基因型個體之間的多態性主要是由于DNA復制和修復過程中堿基滑動、錯配或減數分裂過程中姐妹染色單體的不均等交換而造成［19，21-22］。

1．3 SSR標記技術原理及特點 SSR最初只是作為探針，用于真核生物基因組的RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制片段長度多態性)研究。隨著PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)技術建立，SSR廣泛應用于DNA標記研究。基于SSR序列的多態性，即同一SSR位點在同種生物不同基因型的重復單元數有很大變化，產生了數種DNA標記技術，如SSR標記、ISSR(Inter-Simple Repeat Sequence，簡單重復序列區間)標記［23］、RAMP(Random Amplified Microsatellite Polymorphisms，隨機擴增微衛星多態性)標記［24］和 REMAP(Retrotransposon Microsatellite Amplified Polymorphisms，逆轉座子微衛星擴增多態性)標記［25］。

SSR標記技術是利用SSR序列比較保守的兩翼序列設計成對引物組合進行PCR擴增，不同基因型樣品的同一位點SSR-PCR產物則有可能會在凝膠(現多為聚丙烯酰胺凝膠)電泳上呈現長度的差異［26］。因SSR-PCR產物在凝膠電泳上呈現DNA片段長度的多態性，SSR標記又被稱為SSLP(Simple Sequence Length Polymorphisms，簡單序列重復長度多態性)標記。SSR標記具有數量多、分布廣泛、呈共顯性遺傳和遺傳信息豐富等特點。同時，SSR標記技術具有位點特異性、共顯性、對DNA需要量少、對DNA質量要求不高、易于PCR檢測、重復性好、操作簡便以及適合高通量分析等特點［27］。PCR標記技術的重復性非常好，對于同一批SSR標記分析，不同工作人員其試驗結果有很好的一致性［28］。

1．4 SSR標記開發 由于SSR標記是特異引物標記，必須先獲取相關DNA序列，以找出相應SSR位點并依據其兩翼序列設計成對PCR引物，才能進行SSR標記分析，所以SSR標記技術存在引物開發的問題［29］。以往獲得SSR位點兩側序列或相應特異引物，通常采用以下途徑:第一，利用SSR引物在近緣物種的通用性以及SSR引物具有很好的重復性能夠在不同實驗室共享等特性，搜集相關研究(主要包括有關文獻)中所用的SSR引物;第二，查詢相關生物信息公共數據庫(如NCBI和EMBL等)，下載研究物種相關DNA序列，對其進行去冗余、去低質量序列和序列拼接處理，再采用軟件(如Primer Premier 5．0或BatchPrimer 3等)設計引物;第三，構建相關DNA或cDNA文庫，篩選SSR位點，然后根據兩翼序列設計引物［30］。

除一些模式植物或主要作物外，通過前2條途徑獲得的植物SSR引物數量通常極其有限，難以滿足遺傳育種應用研究的需要，為此需要采用第3條途徑開發SSR標記。關于采用此途徑挖掘SSR位點或開發相應引物，目前報道有很多種策略［29，31-32］。然而，這些策略，其試驗過程都非常復雜，而且還需要大量的測序，因此，通過此途徑開發SSR引物費時費力，需要很高的試驗費用。而且，即便采用此方法挖掘SSR位點，所獲得SSR位點的數量也非常有限，使得SSR標記技術在植物研究中的更廣泛應用受到了瓶頸性制約影響。

植物的一個全基因組或轉錄組上SSR位點十分豐富，其數量可達數萬甚至幾十萬個［33］，這些SSR位點都是植物SSR標記應用研究所需要的寶貴資源。以前限于Sanger測序能力有限，從中開發出的SSR標記數量微乎其微。隨著近些年來新一代測序(Next-Generation Sequencing，NGS)技術與生物信息學工具異軍突起，通過全基因組測序或轉錄組測序便可以將一個植物的整個基因組或轉錄組上絕大部分SSR位點挖掘出來，這為絕大多數植物SSR標記大量開發提供了一種重要捷徑［34-35］。

盡管植物基因組蘊含的SSR位點數量比轉錄組含有的SSR位點數量高出幾倍甚至數十倍［33］，但基于轉錄組測序平臺開發SSR標記的相關研究仍發展較快。究其原因，轉錄組測序技術已逐步取代基因芯片技術成為目前在全基因組水平上研究基因表達的主流方法。通過該技術，可以獲得某一生物樣品的低表達基因、不同樣品間的表達差異、轉錄發生位點、轉錄本表達豐度以及SNP等重要結果［35-36］。進行SSR標記開發研究，也已逐漸成為植物轉錄組測序分析的一項重要內容。而且，從轉錄組測序獲得的SSR都是ESTSSR，其序列都是轉錄本，因而這些SSR可能會與某些功能基因相關，開發出來的SSR標記有可能成為與某些生物表型性狀相關的分子標記［37］。另外，雖然轉錄組EST-SSR多態性比基因組SSR低，但在近緣關系的植物之間可能有更好的通用性［38］。近年來，已有很多植物(包括楊梅)通過轉錄組測序技術開發了大量的 SSR標記［34，38-48］，與基于新一代測序技術開展的全基因組 SSR標記研究，如在楊梅［49-50］、可可［51］、玉米［52］、芝麻［53］、棗［54］、白菜［55］等植物上，相得益彰。

2 楊梅SSR標記研究概況

2．1 國外研究概況 楊梅是我國特色栽培果樹，其在國外分布很少，關于楊梅SSR標記研究也僅有2篇報道。2006年，Terakawa等［11］從富集CT重復序列的楊梅基因組文庫克隆文庫中開發出了13個SSR標記，并對32個楊梅樣品進行了標記鑒別和遺傳多樣性分析。2009年，Terabawa等［56］又利用其中10個SSR標記，分析所研究區域福島獼猴糞便所含楊梅種子的遺傳多樣性，發現福島獼猴散播種子在楊梅種群遺傳多樣性的形成和維持中起著重要作用。

2．2 國內研究概況 國內學者對楊梅SSR標記研究已有8篇(有7篇為外文)，除其中1篇(Xie等［57］)作者所在單位為浙江省農業科學院園藝研究所外，其他7篇均由浙江大學果樹科學研究所的研究者發表。

2009年，Zhang等［58］從‘荸薺’楊梅不同組織 EST文庫克隆片段序列和克隆的MYB相關基因cDNA序列中分別獲得了9個和2個SSR位點，并用保存在浙江省余姚市的中國楊梅資源圃［7］中的32個楊梅品種分析了各個SSR位點的多態性特征。2011年，Xie等［59］利用已研究的14個 SSR標記［11，58］，采用熒光SSR標記技術，對保存在上述楊梅資源圃內的122個楊梅樣品(主要來源于我國7個省)和1個蠟楊梅(M．cerifera)樣品進行了遺傳聚類分析，將其分為幾個類別，并發現同一地理區域的樣品遺傳差異相對較小;又用其中的10個SSR標記構建了52個主要樣品的DNA指紋圖譜;發現楊梅的SSR引物可以通用于蠟楊梅相關研究。Xie等［57］以G(G/C)G(GT)6作為富集SSR序列的引物，利用ISSR抑制PCR法，從‘黑晶’楊梅基因組DNA中獲得了完全型和復合型SSR位點各6對引物，并用24個楊梅和2個矮楊梅(M．nana)作為樣品進行篩選，從中開發出了9個SSR標記，該研究為楊梅或其他一些植物SSR標記開發提供了一種策略或思路。

2012 年，Jiao等［49］采用Illumina Hi-Seq 2000 測序平臺對用楊梅株系‘C1020-55’所構建250和500 bp的基因組文庫進行高通測序，產生了9．01 Gb序列數據(楊梅基因組323 Mb的26倍覆蓋度)，應用 MISA(http://pgrc．ipk-gatersleben．de/misa/misa．html)從初步拼接的各 scaffold序列片段(總大小為255 Mb)中鑒別出28，602個SSR位點(不含單核苷酸和非完全型SSR位點)，發現二核苷酸SSR數量最大(占總量的 84．73%)，用 BatchPrimer3 軟件(http://pgrc．ipk-gatersleben．de/misa)設計引物，從中選取600對引物，并用29個楊梅和3個楊梅屬其他植物樣品進行多態性標記篩選出158個SSR標記(每個SSR位點平均可產生8．25個等位條帶，多態性信息含量平均為0．67)，并對所獲得SSR標記在楊梅屬植物間的通用性進行了分析。基于Feng等［60］的‘荸薺’楊梅Illumina Hi-Seq 2000轉錄組測序數據，通過重頭拼接所獲得41 239條 Unigenes序列(總大小為20．9 Mb，平均大小為539 bp)，Zhang等［43］利用MISA軟件鑒別ESTSSR位點，發現6883個EST-SSR位點位于5 472條Unigenes上(出現頻率為每3．2 Kb含1個 EST-SSR位點)，每個位點序列長度為10～48 bp，二核苷酸和三核苷酸EST-SSR位點所占比例超過總量的75%，有1326個EST-SSR位點包含在594個復合EST-SSR序列中，其他5557個位點則為完全型ESR-SSR;從6 151個EST-SSR中，選取412個用于設計SSR引物，成功設計267對引物，并用10個楊梅主要品種(系)，篩選出109個EST-SSR標記(產生了389個等位片段，多態性比率為 93．8%)。

2014 年，Jia等［50］基于 Jiao等［49］高通測序結果又開發出了107個SSR標記。至此，楊梅研究可用的SSR標記(包括EST-SSR標記)由2012年前的36個上升至410個，為楊梅種質資源SSR標記研究奠定了良好基礎。在上述研究中，Jia等［50］用所獲得全部SSR標記對45個楊梅樣品進行遺傳關系分析，確認了研究小組前期研究結論，使得各主要楊梅品種(品系)遺傳關系更為明確;優系‘Y2010-70’、‘Y2012-140’及‘Y2012-145’也被從基因型上確定為新品系。汪國云等［61］基于 Xie等［57］構建的楊梅品種鑒別指紋圖譜結果，選用相同的引物，對9個楊梅品種，基于遺傳測序儀高效和自動化特性，構建了多重熒光SSR標記鑒別DNA指紋圖譜，為相應果實質量檢測及優良品系選擇提供了很大便利。

2015 年，基于前期研究［43］，Zhang 等［62］對楊梅 11 個類型EST-SSR的多態性(包括多態性比率和單個位點多態性水平)比較研究，發現不同類型EST-SSR多態性差異十分顯著，研究結果對于楊梅和其他果樹轉錄組(或基因組)多態性SSR標記的高效率篩選具有較好的參考作用。

3 總結與展望

SSR標記技術具有其他DNA標記技術無可比擬的優勢，新一代測序技術能夠大大推動許多植物SSR標記的大量開發，SSR標記技術也將得到更為廣泛的應用。作為我國特色的果樹種質資源，近年來，國內對楊梅SSR標記研究已取得長足進展，開發了眾多的SSR標記，并在一定程度明確了許多重要楊梅品系的親緣關系，為后續更多的楊梅種質資源SSR標記研究奠定了良好基礎。

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