舒芬太尼后處理對2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其與PI3K-Akt通路的關系*

任 強王建剛田首元

舒芬太尼后處理對2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其與PI3K-Akt通路的關系*

任 強①王建剛②田首元②

目的：研究舒芬太尼后處理對2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路的關系。方法：健康雄性SD大鼠24只，體重180～200 g，采用隨機數字表法將其隨機分為四組（n=6）：非糖尿病假手術組（NDM-S組）、非糖尿病缺血再灌注組（NDM-I/R組）、非糖尿病舒芬太尼后處理組（NDM-SP組）、非糖尿病舒芬太尼后處理+渥曼青霉素（PI3K抑制劑）組（NDMSP+W組）。另取健康雄性SD大鼠，采用高糖高脂飲食喂養6周誘導胰島素抵抗+腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg的方法制備2型糖尿病模型（血糖≥16.7 mmol/L），選取造模成功的大鼠24只，繼續高糖高脂喂養2周后采取隨機數字表法，將其分為四組（n=6）：糖尿病假手術組（DM-S組）、糖尿病缺血再灌注組（DM-I/R組）、糖尿病舒芬太尼后處理組（DM-SP組）、糖尿病舒芬太尼后處理+渥曼青霉素組（DM-SP+W組）。采用左冠狀動脈前降支下穿線或結扎，阻斷30 min，再灌注120 min的方法制備大鼠心肌缺血再灌注的模型。其中假手術組只穿線不結扎；缺血再灌注組穿線后穩定5 min，阻斷30 min，再灌注120 min；舒芬太尼后處理組于再灌注前5 min經舌下靜脈注射舒芬太尼1.0 μg/kg；舒芬太尼后處理+渥曼青霉素組于再灌注前5 min經舌下靜脈注射渥曼青霉素15 μg/kg和舒芬太尼1.0 μg/kg。再灌注120 min后取血樣，測定肌鈣蛋白cTnI的濃度；處死后收集心肌組織，采用TUNEL法測定心肌細胞的凋亡指數（AI），采用Western blot法檢測心肌組織Akt、p-Akt的表達水平。結果：非糖尿病和糖尿病大鼠I/R組、SP組、SP+W組與S組相比較，血漿cTnI的濃度升高、AI增加、p-Akt的表達增加（P＜0.05）。舒芬太尼后處理可明顯減輕NDM組的心肌缺血再灌注損傷，使升高的cTnI濃度降低、AI降低、p-Akt的表達增加（P＜0.05），而對DM組心肌缺血再灌注損傷的各項指標均無明顯的影響。NDM-SP組的血漿cTnI的濃度、AI明顯低于DM-SP組而p-Akt的表達高于DM-SP組。結論：舒芬太尼后處理對2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷沒有保護作用，PI3K-Akt通路不參與該過程。

舒芬太尼后處理； 2型糖尿病； 心肌缺血再灌注損傷； PI3K-Akt

隨著我國進入人口老齡化社會，糖尿病（diabetes mellitus DM）嚴重的威脅著人類的健康，已經成為缺血性心臟病最重要的易患因素，糖尿病人群更易罹患冠心病導致的心肌梗死和梗死后并發癥[1]。2型糖尿病作為最普遍的糖尿病類型，在糖尿病人群中占有很大的比重。因此，減輕由2型糖尿病因素導致心肌缺血再灌注損傷就顯的具有迫切的臨床意義。舒芬太尼是一種強阿片類鎮痛藥，具有消除半衰期短、鎮痛作用強、血流動力學影響輕微等優點，被廣泛應用于心血管手術的麻醉[2]。研究表明，舒芬太尼后處理可減輕非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷，其機制與PI3K-Akt通路有關[3]，但是舒芬太尼后處理對2型糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注損傷是否有保護作用及其與PI3K-Akt通路的關系，目前的研究尚不多見。本實驗擬研究舒芬太尼后處理對2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其與PI3K-Akt通路的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，體重180～200 g，山西醫科大學動物實驗中心提供。參展文獻[4]的方法制備2型糖尿病模型。高糖高脂飼養6周后，腹腔注射鏈脲佐菌素（批號：905B0314，Solarbio公司）35 mg/kg，72 h后測量空腹血糖≥16.7 mmol/L并伴有糖尿病癥狀（多食、多飲、多尿、毛發變黃等）即可視為2型糖尿病大鼠模型制備成功，繼續高糖高脂飼養2周后可用于本實驗。溫度18～25℃，濕度50％～60％，自由飲水。

1.2 實驗分組 取健康的正常SD大鼠24只，按照隨機數字表法將其分為四組（n=6）：非糖尿病假手術組（NDM-S組）、非糖尿病缺血再灌注組（NDM-I/R組）、非糖尿病舒芬太尼后處理組（NDM-SP組）、非糖尿病舒芬太尼后處理+渥曼青霉素組（NDM-SP+W組）。另取造模成功的糖尿病大鼠24只，按照上述方法分為四組（n=6）：糖尿病假手術組（DM-S組）、糖尿病缺血再灌注組（DM-I/R組）、糖尿病舒芬太尼后處理組（DM-SP組）、糖尿病舒芬太尼后處理+渥曼青霉素組（DM-SP+W組）。

1.3 心肌缺血再灌注模型的制備 參照文獻[5]進行大鼠心肌缺血再灌注模型的制備。腹腔注射20％的烏拉坦3 mL/kg麻醉后，仰臥位固定于實驗臺上，針狀電極刺入左、右前肢和右后肢皮下，動態監測Ⅱ導聯心電圖。行氣管切開置管并連接HX-300小型動物呼吸機行機械通氣，呼吸機參數設置為：潮氣量8～10 mL，吸呼比1：2，頻率65 次/min。于左側胸壁第3～5肋間胸骨左緣0.5 cm處開胸，鈍性分離肌肉，剪斷肋骨打開胸腔，暴露出心臟并剝離心包膜，以左冠狀靜脈主干為標志，在左心耳下方可見一明顯的血管即為左冠狀動脈前降支，用7-0線結扎左冠狀動脈前降支，制備心肌缺血再灌注模型。造模成功的標志為：結扎后心尖部缺血發白，心電圖ST段抬高，T波高聳，結扎線以下心肌組織發紺并活動減弱；松開結扎線后，心電圖抬高ST段或T波逐漸回落，心肌組織反應性充血。上述S組只穿線不結扎；SP組于再灌注前5 min經舌下靜脈注射舒芬太尼（批號1130902，宜昌人福醫藥有限責任公司）1.0 μg/kg；SP+W組于再灌注前5 min分別經舌下靜脈注射渥曼青霉素（批號LG10014，北京百靈威科技有限公司）15 μg/kg、舒芬太尼1.0 μg/kg。

1.4 cTnI的測定 再灌注120 min后，大鼠開腹找到腹主動脈取血2 mL，4 ℃ 4000 rpm/min離心15 min，后移取上清液于-80 ℃冰箱中保存。使用ELISA法檢測血清中cTnI濃度（試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供）。

1.5 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 再灌注120 min后取下心尖組織，4％多聚甲醛固定，常規石蠟切片。按TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供）說明書進行操作：切片后常規脫蠟后用PBS緩沖液漂洗，3％H2O2封閉內源性過氧化物酶，蛋白酶K消化，加TUNEL反應液，漂洗，加酶標抗體，DAB顯色，蘇木素復染。每張切片光鏡（400倍）下隨機選取5個高倍視野，計算凋亡指數（apoptotic index，AI），即凋亡細胞數占心肌細胞總數的百分比，取5個視野的平均值。

1.6 心肌Akt、p-Akt蛋白表達的測定 再灌注120 min后取左心室100 mg，用生理鹽水漂洗數次，剪碎后加入裂解液，14 000 g/min離心5 min，取上清液，用BCA法進行蛋白定量。根據蛋白定量結果加入總蛋白樣品和上樣緩沖液，煮沸5 min，然后在12％分離膠/5％積層膠上進行電泳，用電轉儀將凝膠上分離到的蛋白轉移到PVDF膜上，5％BCA封閉2 h，用兔抗鼠Akt和p-Akt單克隆抗體（稀釋度1：10 000，ABCAM公司，美國）4 ℃孵育過夜，次日用HRP標記的羊抗兔二抗（稀釋度1：5000，武漢博士德生物工程有限公司）孵育2 h，加ECL發光液顯影。采用凝膠成像系統進行分析，以目的蛋白條帶灰度值和GAPDH條帶灰度值的比值反映Akt和p-Akt蛋白的表達。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，多組均數及組間兩兩比較采用單因素方差分析和最小顯著差異法（LSD法），非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠各指標的比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠體重和血糖的比較 與非糖尿病大鼠比較，糖尿病大鼠進食、進水和尿量均明顯增加，毛發發黃易脫落，體重下降，血糖明顯升高（P＜0.05），見表1。

表1 非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠體重和血糖的比較（±s）

表1 非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠體重和血糖的比較（±s）

*與非糖尿病大鼠比較，P＜0.05

種類體重（g）血糖（mmol/L）非糖尿病大鼠（n=24）368±12 5.6±0.8糖尿病大鼠（n=24） 316±24*22.4±3.6*

2.2 各組大鼠血cTnI濃度和AI的比較 非糖尿病大鼠中：與NDM-S組相比較，NDM-I/R組、NDMSP組和NDM-SP+W組血漿中cTnI的濃度、心肌細胞的AI均升高（P＜0.05）；與NDM-I/R組比較，NDM-SP組血漿中cTnI的濃度、心肌細胞的AI均降低（P＜0.05），NDM-SP+W組血漿中cTnI的濃度、心肌細胞的AI差異無統計學意義（P＞0.05）；與NDMSP組相比較，NDM-SP+W組cTnI的濃度、心肌細胞的AI均升高（P＜0.05）。糖尿大鼠中：與DM-S組相比較，DM-I/R組、DM-SP組和DM-SP+W組血漿中cTnI的濃度、心肌細胞的AI均升高（P＜0.05）；DM-I/R組、DM-SP組、DM-SP+W組之間cTnI的濃度、心肌細胞的AI兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與NDM-SP組相比較，DM-SP組cTnI的濃度、心肌細胞的AI均升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血cTnI濃度和AI的比較（±s）

表2 各組大鼠血cTnI濃度和AI的比較（±s）

*與NDM-S組相比較，P＜0.05；△與NDM-SP組相比較，P＜0.05；#與DM-S組相比較，P＜0.05

組別cTnI（μg/L）AI（％）NDM-S組（n=6）0.35±0.08 7.0±1.4 NDM-I/R組（n=6）1.14±0.16*△35.2±2.3*△NDM-SP組（n=6）0.73±0.52*24.2±2.1*NDM-SP+W組（n=6）1.12±0.41*△34.8±2.5*△DM-S組（n=6）0.42±0.09 7.2±1.7 DM-I/R組（n=6）1.18±0.38#35.9±2.2#DM-SP組（n=6）1.20±0.42△#36.6±2.3△#DM-SP+W組（n=6）1.21±0.29#36.2±1.9#

2.3 各組大鼠心肌Akt、p-Akt表達水平的比較 各組大鼠心肌組織中Akt的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。非糖尿病大鼠中：與NDM-S組相比較，NDM-I/R組、NDM-SP組和NDM-SP+W組心肌組織中p-Akt的表達增加（P＜0.05）；與NDM-I/R組相比較，NDM-SP組心肌組織中p-Akt的表達增加（P＜0.05），NDMSP+W組心肌組織中p-Akt的表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與NDM-SP組相比較，NDM-SP+W組心肌組織中p-Akt的表達減少（P＜0.05）。糖尿病大鼠中：與DM-S組相比較，DM-I/R組、DM-SP組和DM-SP+W組心肌組織中p-Akt的表達增加（P＜0.05）；DM-I/R組、DM-SP組、DM-SP+W組之間p-Akt的表達兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與NDM-SP組相比較，DM-SP組心肌組織中p-Akt的表達減少（P＜0.05）。見表3、圖1～3。

表3 各組大鼠心肌Akt、p-Akt表達水平的比較（±s）

表3 各組大鼠心肌Akt、p-Akt表達水平的比較（±s）

*與NDM-S組相比較，P＜0.05；△與NDM-SP組相比較，P＜0.05；#與DM-S組相比較，P＜0.05

組別Aktp-Akt NDM-S組（n=6）0.85±0.210.615±0.006 NDM-I/R組（n=6）0.79±0.250.859±0.006*△NDM-SP組（n=6）0.76±0.231.052±0.005*NDM-SP+W組（n=6）0.81±0.240.856±0.005*△DM-S組（n=6）0.78±0.220.622±0.003 DM-I/R組（n=6）0.83±0.190.860±0.004#DM-SP組（n=6）0.80±0.230.856±0.005△#DM-SP+W組（n=6）0.79±0.200.863±0.006#

圖1 Akt蛋白濃度表達

圖2 p-Akt蛋白濃度表達

圖3 GAPDH蛋白濃度表達

3 討論

研究認為，圍術期糖尿病患者心臟危險事件發生率在50％以上，其麻醉和手術風險是非糖尿病患者2～3倍[6]。糖尿病患者行心臟外科手術發生心肌缺血再灌注損傷的后果更為嚴重，預后很差。因此探討如何減輕糖尿病患者的心肌缺血再灌注損傷顯得尤為重要。本研究參照文獻[7-8]確定舒芬太尼和渥曼青霉素的給藥時間及劑量。

PI3K-Akt信號轉導通路參與了細胞許多的生理過程，包括調節細胞分裂、分化和凋亡等活動，是生命活動中的關鍵信號分子。PI3K可磷酸化肌醇環上的3位羥基，生成三磷酸磷脂酰肌醇，三磷酸磷脂酰肌醇作為第二信使，使Akt磷酸化后激活，活化后的Akt（p-Akt）可激活eNOS，eNOS是生成NO的限速酶，是PI3K-Akt信號轉導通路的重要下游效應分子。p-Akt通過激活eNOS，促進心肌細胞合成NO，NO可減少線粒體通透性轉化孔開放（MPTP）[9]。MPTP被認為是心肌保護作用的關鍵通道，MPTP開放后線粒體內促凋亡物質細胞色素C（CytC）和凋亡誘導因子（AIF）釋放至胞質中，分別通過不同途徑誘導細胞凋亡。因此減少MPTP的開放可以起到減輕心肌缺血再灌注損傷的作用[10]。研究顯示，PI3K-Akt信號轉導通路介導了人參皂苷Rb1預處理減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的過程[11]。

本研究結果表明，除了DM-S組和NDM-S組外，其他組大鼠心肌缺血后，心電圖ST段抬高呈弓背向上型，T波高聳，再灌注后血清中cTnI的濃度升高。cTnI增高可作為心肌損害的重要證據[12]，提示大鼠心肌缺血再灌注模型制備成功。與DM-S組和NDM-S組相比較，其余各組p-Akt表達增加，提示心肌缺血再灌注損傷與PI3K-Akt通路有關。舒芬太尼后處理能夠減輕非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷，使血漿中cTnI的濃度降低、AI降低、p-Akt的表達增加。給予PI3K拮抗劑渥曼青霉素后，其保護作用消失，提示PI3K-Akt通路介導了舒芬太尼后處理對非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。糖尿病大鼠在給予舒芬太尼后處理，上述指標未見明顯改變，提示舒芬太尼后處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷沒有保護作用，PI3K-Akt通路不參與該過程。研究表明糖尿病因素可通過影響糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）上游多條信號通路的磷酸化水平來減弱嗎啡后處理的心肌保護作用[13]。因此推斷糖尿病因素可能是通過GSK-3β的蛋白磷酸化水平阻礙了舒芬太尼后處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。心肌缺血再灌注損傷程度與2型糖尿病的病程有關，病程越長，心肌損傷越嚴重[14]。另外本實驗選擇的舒芬太尼給藥量對于2型糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注損傷來說劑量可能不夠。所以，舒芬太尼后處理對非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷產生的不同影響及其機制還有待后期進一步的研究。

綜上所述，舒芬太尼后處理對2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷沒有保護作用，PI3K-Akt通路不參與該過程。

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The Effect on Type Ⅱ Diabetes Mellitus of the Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury by Sufentanil Postconditioning in Rats and its Relation with PI3K-Akt Pathway

REN Qiang，WANG J ian-gang，TIAN Shou-yuan.//Medical Innovation of China，2015，12（09）：016-020

Objective：To investigate the effect on type Ⅱ diabetes mellitus of the myocardial ischemia-reperfusion injury by sufentanil postconditioning in rats and its relation with PI3K-Akt. Method：24 healthy male SD rats weighing from 180-200 g were randomly divided into 4 groups by random number table method （n=6）： nondiabetic mellitus sham operation group （NDM-S group）， nondiabetic mellitus ischemia-reperfusion group （NDM-I/R group）， nondiabetic mellitus sufentanil postconditioning group （NDM-SP group） and nondiabetic mellitus sufentanil postconditioning + wortmannin （PI3K-inhibitor） group （NDM-SP+W group）. More healthy male SD rats were made into T2DM model（Glucose≥16.7 mmol/L） by the following method： feeding them with high-sugar and high-fat diet for 6 weeks to induce insulin resistance and giving intraperitoneal injection of streptozotocin with the dosage of 35 mg/kg. Selected 24 rats that were successfully molded and keeping on feeding them with high-sugar and high-fat diet for 2 more weeks. to They were divided into 4 groups （n=6） by random number table method： diabetic mellitus sham operation group （DM-S group），diabetic mellitus ischemia-reperfusion group （DM-I/R group）， diabetic mellitus sufentanil postconditioning group （DMSP group） and diabetic mellitus sufentanil postconditioning + wortmannin group （DM-SP+W group）. The model of ratswith myocardium ischemic reperfusion was made by the following method： carrying out threading or ligation below the left anterior descending branch of coronary artery， blocking for 30 min and giving reperfusion for 120 min. But threading can only be carried out for the sham operation groups. After 5 min’s stabilization of the ischemia-reperfusion groups， it should be blocked for 30min and reperfused for 120 min. For sufentanil postconditioning groups， sublingual IV injection of 1.0 μg/kg sufentanil was given 5 min before the reperfusion， while sublingual IV injection of 15 μg/kg wortmannin and 1.0 μg/kg sufentanil were given for the sufentanil postconditioning + wortmannin groups. Blood sample was taken after 120 min’s reperfusion to check the cTnI level. Myocardial tissues were collected after rats’ death to check the AI of cardiomyocytes by TUNEL method and the Akt， p-Akt level of myocardial tissues by Western blot method.Result：Compared I/R， SP and SP+W groups with S group of both NDM and DM rats， the cTnI level in plasma of the former groups was obviously elevated， as well as increased AI and p-Akt level（P＜0.05）. Sufentanil postconditioning could obviously reduce the MI/RI of NDM group， which could lower the cTnI and AI level and increase the p-Akt level（P＜0.05）， but it had no obvious effect on the MI/RI of DM group. The cTnI level in plasma and AI of the NDM-SP group were obviously lower than the DM-SP group， while the p-Akt level of former group is higher than the latter.Conclusion：Sufentanil postconditioning has no protective effect on type Ⅱ diabetes mellitus against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats and PI3K-Akt pathway is not involved in this process.

Sufentanil postconditioning； Type Ⅱ diabetes mellitus； Myocardial ischemia-reperfusion injury； PI3K-Akt

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.006

2014-08-04） （本文編輯：蔡元元）

山西省自然科學基金（2013011049-2）

①山西醫科大學麻醉學系 山西 太原 030001

②山西醫科大學第一臨床醫學院

王建剛

First-author’s address：Shanxi Medical University Department of Anesthesia，Taiyuan 030001，China