高通量RNAi及其在細胞生物學特性研究中的應用

信吉閣,曾養志

(1.云南農業大學動物科學技術學院,云南昆明 650201；2.云南省版納微型豬近交系重點實驗室,云南昆明 650201)

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高通量RNAi及其在細胞生物學特性研究中的應用

信吉閣1,2,曾養志2

(1.云南農業大學動物科學技術學院,云南昆明 650201；2.云南省版納微型豬近交系重點實驗室,云南昆明 650201)

高通量RNAi(high-throughput screens HTSs)技術是近年來基因功能研究的高效工具。現已在多個物種的細胞內進行了大量基因組范圍RNAi高通量篩選，用于研究多種不同的生物學過程，為生物醫學研究提供了技術基礎。就高通量RNAi技術原理、實驗操作及其在研究與細胞生物特性相關基因中的主要應用進展進行了綜述。

RNAi；高通量；細胞學

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是高通量分析基因功能的有效工具。近年來在果蠅和哺乳動物細胞內進行了許多基因組RNAi高通量篩選(RNAi high-throughput screens ,HTSs)，用于研究多種不同的生物學過程，包括信號傳導、癌生物學、宿主細胞對感染的反應等。利用RNAi HTSs發現了許多生物過程中的結構組分，并對復雜的生物系統提出了一些新的理論，進而形成具有創新性的研究細胞功能的方法。筆者對高通量RNAi技術原理、試驗操作及其在研究與細胞生物特性相關基因中的應用進行了綜述。

1 高通量RNAi篩選

RNAi是RNA依賴的基因沉默現象，是雙鏈RNA (double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA 水平上誘導的序列特異性的轉錄后基因表達沉默，可對內源或外源dsRNA發生反應，以序列特異的方式下調(降低但不消除)靶RNA[1-2]。2006年諾貝爾生理學或醫學獎授予美國科學家Andrew Fire 和Craig Mello，以表彰他們發現了RNAi機制。近年來在此領域開展了多個方向的研究，如21～28 nt長度的小RNA的起源和功能研究，包括microRNAs(miRNAs)、內源短干擾RNAs(endo-siRNAs)等，這些研究從嶄新的角度闡明了一些生物學觀點[3-5]，同時RNAi誘導產物也已應用于醫學治療[6]。RNAi作為在mRNA水平進行特異敲除的分子工具，廣泛應用于細胞、組織、器官的基因功能研究，如秀麗線蟲、果蠅、哺乳細胞、扁蟲、擬南介等[7-10]。

RNAi技術與DNA和基因測序數據結合，有希望構建RNAi反應物全基因組文庫，廣泛應用于多種細胞類型中[11]。HTSs技術可在全基因組范圍內系統地研究特定細胞表型對應的內在功能基因，進行系統功能分析，突破了先前只能在相對小的范圍內選擇易操作的模型器官中進行的局限，同時可在多基因互作下分析藥物作用，得到用于臨床藥物治療效果評價的標志基因或藥物治療的新靶點基因[12]。在此領域最重要的應用是能夠在哺乳動物細胞中進行全基因組范圍RNAi HTSs。目前在哺乳動物細胞中進行RNAi篩選已經得到了大量有重要生物醫學意義的結果，包括鑒定新的致癌基因、可能的靶位點，醫學治療等[13-15]。

2 高通量RNAi篩選實驗方法

在研究某一基因的功能時，可利用RNAi下調該基因表達，直接或間接檢測到基因表型和功能的改變。RNAi既可用于小范圍的基因研究也可用于高通量基因篩選。以細胞為基礎的RNAi HTSs，通常有2種可供選擇的篩選方式，一種是合并的形式，文庫以隨機的方式引入細胞，一種是排列的形式，在微量滴定板每個孔上分別轉染單個基因[16]。這2種方法都已成功地應用到研究中。合并方法在標準實驗室設備下比陣列篩選更可行，陣列篩選需要自動化和特殊的陣列讀出儀器，但陣列篩選在檢測后，可通過數據庫或電子數據表簡單地查找在已知測定孔反應物特征，很容易判定哪些細胞是由哪些特異RNAi反應物處理的。

特異的下調的RNAi反應物在不同細胞類型、組織、不同測定法中也不同，在細胞基礎的HTSs采用的典型的四類型的RNAi反應物是dsRNAs、siRNAs、shRNAs、esiRNAs。不同細胞類型適宜的導入系統也不同。常見的導入系統包括shRNAs病毒轉導，shRNAs、siRNAs、esiRNAs或dsRNAs脂介質轉染或電轉[16]，或對于果蠅細胞可簡單地把細胞和dsRNAs在溶液中混合。在RNAi HTSs中需要考慮一些重要因素，包括進行至少1次重復試驗，選擇適宜對照，數據質量早期評估等[17]。

3 高通量RNAi篩選的應用

盡管與其他經典基因篩選相比， RNAi HTSs還處于發展初期，但已開展了大量研究，并對許多領域產生了重要影響，尤其是在細胞功能、信號轉導、癌癥生物學等方面。在果蠅和哺乳動物細胞中已對多種細胞生物過程進行了研究。

3.1 細胞活力和擴增細胞擴增和存活與人類疾病，如癌癥有特別的關系。現已建立起完善的以自動方式檢測細胞數量、活力和基本代謝的常規方法。早期細胞基礎RNAi HTSs研究中，進行了大量篩選用以鑒定與細胞擴增，存活相關的基因[18]。而近期研究已篩選出多種與哺乳動物細胞生存和擴增相關的基本因子，特別是癌癥細胞的基本因子[19]。這些研究都表明在多種細胞類型中有幾個基因與細胞存活或擴增相關。

3.2 細胞分裂、細胞死亡和細胞周期采用混合式篩選或簡單可行的試驗可檢測細胞增殖或活力變化，利用特異報告子、細胞循環FACS分析或以圖像為基礎的檢測讀出器可揭示出與細胞分裂、細胞死亡或相關過程有關的特異表型。這些研究結果包括發現許多人類激酶、磷酸酶、蛋白質是與蛋白水解相關的[20]；許多蛋白與中心體增殖有關[21]；早期esiRNA為基礎的篩選在人類HeLa細胞中鑒別了多種與有絲分裂和細胞質分裂等方面相關的候選基因[22]。

3.3 細胞死亡和生理節奏在哺乳動物細胞中的一項研究表明，許多基因需要RIP1激酶介導細胞壞死和細胞凋亡[23]。細胞死亡也是在果蠅細胞中進行篩選的特異熱點[24]，與新陳代謝調節子如Charlatan和ARD1在半胱天冬酶激酶有關[24]。此外，人類晝夜節律鐘中激酶和磷酸激酶研究發現酪蛋白激酶2能被PER2磷酸化。鈣在細胞功能上的作用也集中在果蠅細胞的多個RNAi HTSs研究中，在這些研究發現了鈣通道和內環境穩定性[25]。

3.4 細胞壓力反應許多篩選分析了細胞對壓力條件的反應，如一項關于果蠅基因RNAi HTSs研究中，檢測細胞對低氧環境的反應，發現了Tor通路組分和蛋白酪氨酸磷酸酯酶61F，在低氧反應翻譯的調節中起重要作用[26]。此外，全基因組綜合掃描哺乳動物基因，發現某些基因的下調能產生對壓力的耐受性[27]。

4 展望

應用RNAi HTSs發現了許多新基因，并已成功地應用于研究許多重要的生物學問題。RNAi HTSs的研究結果驗證了許多基因與特定的過程相關的這一觀點，如細胞活性、信號轉導、宿主病原體相互作用等，與篩選獲得的不同通路和復合體高度聯系又相互獨立。然而高效的RNAi篩選仍需要大規模的試驗驗證和高效的RNAi試劑的支持，對高通量的驗證方法以及在體內證實RNAi結果是有意義的研究方向。隨著基因、轉錄組、蛋白質組學等相關技術的發展，RNAi HTSs將作為基因功能研究的有效工具，為生物和生物醫學作出更多貢獻。

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RNAi High-throughput Screens and Its Application in Cell Biology Research

XIN Ji-ge1,2, ZENG Yang-zhi2

(1. Animal Science and Technology College, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201; 2. Key Laboratory of Banna Mini-pig Inbred Line of Yunnan Province, Kunming, Yunnan 650201)

RNAi high-throughput screens(HTSs) is an effective tool for analysis of gene function in genome-scale. Now a number of genome-scale RNAi HTSs have been done in cultured cells of many species to study diverse biological processes. The RNAi HTSs have made important contributions to the developments of biomedicine. The RNAi technology principle, experimental manipulation and its application in the related gene of cell biology research were reviewed.

RNAi; High-throughput screens; Cytology

國家自然科學基金項目(31360532)；云南省應用基礎研究計劃項目(2013FB041)。

信吉閣(1981- )，女，吉林樺甸人，實驗師，博士，從事胚胎生物技術研究。*通訊作者，教授，從事遺傳學方面的研究。

2014-12-02

S 188

A

0517-6611(2015)02-012-02