小麥基因組DNA甲基化研究進展

敖 游 (哈爾濱師范大學，黑龍江哈爾濱150025)

1942年Waddington首次提出表觀遺傳學(epigenetics)的概念，指出表觀遺傳與遺傳是相對的，主要研究基因型與表型的關系。目前表觀遺傳學主要研究在DNA序列未發生變異的情況下，而基因功能卻發生改變，這種改變可隨細胞有絲分裂與減數分裂遺傳下去的現象［1－2］。表觀遺傳變異主要包括DNA和組蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化等共價修飾及染色質結構的變化。DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因組中最常見的一種DNA共價修飾形式，是表觀遺傳學的一個重要研究領域，同時，DNA甲基化對于很多生物進程起重要作用，包括基因和轉座子沉默、基因組印記、X染色體失活等［3］。筆者對小麥基因組DNA甲基化研究進展進行了綜述。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是指DNA復制后，由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)催化，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methfonine，SAM)為甲基(-CH3)供體，將甲基連接到DNA分子的腺嘌呤或胞嘧啶堿基上，進行DNA修飾的過程，此過程并不改變DNA的一級結構。

1.1 DNA甲基化酶 DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，Dnmt)是催化和維持DNA 甲基化的酶［4］。目前，已知的植物DNA甲基化轉移酶按照同源性及功能可分三類:①維持DNA甲基化轉移酶(MethyltransferaseI，METI)，其首先從擬南芥中分離出來，如果植物缺失METI，會出現CG位點甲基化降低現象［5］;②染色質甲基化酶(Chromomethylase，CMT)，與METI結構相似，但不同的是其中插入了能與DNA結合的基序。最初是在擬南芥的AtCMT3基因中發現CMT成員，在AtCMT3突變體中導致著絲粒區域CNG位點去甲基化，并激活轉座子［6］;③結構域重新甲基化酶(Domains Rearrged Methyltransferase，DRM)，與哺乳動物的從頭甲基轉移酶(de novo methyltransferase3，DNMT3)家族具有同源性，包括DRM1、DRM2、Zmet3，其作用是對從頭甲基化DNA與保持轉座子及轉基因沉默胞嘧啶的甲基化修飾［7］。

1.2 DNA甲基化修飾方式 DNA甲基化修飾方式有2種:一種是維持甲基化，甲基化酶(如METI和CMT)將甲基從SAM催化轉移到未甲基化的胞嘧啶堿基的嘧啶環上，使其完全甲基化。另一種是重新甲基化，甲基化酶(如DRM)催化子鏈中原母鏈并未甲基化的胞嘧啶位點甲基化。兩者都不改變基因組的堿基序列，在一些蛋白質或RNA的協同作用下，調控基因表達［8］。

1.3 DNA甲基化檢測 目前常用的植物DNA甲基化分析的方法有甲基化敏感擴增多態性分析法(MSAP)、高效液相色譜法(HPLC)、亞硫酸鹽測序法、甲基化敏感限制性內切酶結合Southern雜交分析法等［9－12］。其中 MSAP分析法與HPLC法在植物DNA甲基化水平及狀態時應用較多。由于植株種類、結構及發育時期不同DNA甲基化可能存在差異，使植物DNA甲基化檢測變得困難，所以需要根據研究材料選擇合適的檢測方法。

2 小麥在生物與非生物脅迫下DNA甲基化研究

逆境脅迫是對植物生長在各種不利環境因素下的總稱，如干旱、冷凍、高溫、高鹽、物理化學誘導等非生物脅迫及病原菌侵染、機械傷害、病蟲害等生物脅迫。植物在自然生長過程中，逆境脅迫不可避免地影響植物的自然生長。

2.1 小麥在生物脅迫下基因組DNA甲基化變化 生物脅迫為植物提供了一種內在表觀遺傳進化的動力源。分析生物脅迫下DNA甲基化的變異模式，有利于全面了解DNA甲基化在表觀調控中的生物學功能。付勝杰等［13］使用葉銹菌脅迫小麥，應用MSAP技術檢測基因組DNA甲基化，未發現葉銹菌誘導穩定且特異DNA甲基化模式的改變，但發現抗病品系與其易感病親本之間存在甲基化差異位點，然而，Akimoto等［14］用白葉枯病菌侵染經過5-氮雜胞苷處理過的水稻，獲得對水稻白葉枯病具有抗性的穩定突變品系。

2.2 小麥在非生物脅迫下基因組DNA甲基化變化

2.2.1 金屬離子脅迫的影響。重金屬能導致人和動物疾病的發生，并影響基因的轉錄及表達，這不僅與重金屬能引起蛋白質損傷有關，同時與DNA損傷及DNA甲基化異常有關［15］。葛才林等［16］采用 HPLC法，檢測了3種不同濃度的重金屬離子(Cu2+、Cd2+、Hg2+)脅迫對小麥和水稻各器官DNA甲基化的影響，結果表明，重金屬Cu2+、Cd2+、Hg2+脅迫可明顯改變作物各器官DNA甲基化水平。作物的葉和穗在各濃度Cu2+、Cd2+、Hg2+脅迫下DNA均能處在高甲基化水平，在較低濃度的Cu2+和Cd2+脅迫下小麥根系發生DNA高甲基化，而在各濃度Hg2+脅迫及較高濃度Cu2+和Cd2+脅迫下小麥根系DNA低甲基化則會出現。黑淑梅［17］通過高效液相色譜法檢測不同濃度Cr6+對小麥幼苗葉片及根系DNA胞嘧啶甲基化的影響，結果顯示，用濃度5～80 mg/L的Cr6+處理3 d齡期小麥幼苗根系或濃度5～100 mg/L的Cr6+處理10 d齡期的小麥幼苗根系DNA胞嘧啶甲基化水平均升高，而100 mg/L的Cr6+引起了3 d齡期幼苗的根系DNA胞嘧啶甲基化水平降低［17］。因此，小麥經過重金屬脅迫處理后，植物體為了降低重金屬脅迫的危害，會產生對重金屬脅迫的應答機制，可能通過升高DNA甲基化水平抑制相關基因的表達或降低某些位點DNA甲基化而促進相關基因的表達，形成保護機制，增強植物對脅迫的抵抗能力，利于植株生長發育［18］。

2.2.2 低溫脅迫的影響。超低溫保存技術是在超低溫條件下植物細胞的代謝活動降低或停止，保持生物材料的穩定性，在植物種質保存中具有廣泛的應用價值［19］。陳芳等［20］將2個品種的小麥種子與幼苗進行處理，即對照組(不進行任何處理)、直接超低溫保存組、玻璃化法超低溫保存組。首先采用AFLP技術分析超低溫保存前后樣品基因組DNA序列，結果無變異發生。進一步采用MSAP技術分析超低溫保存前后樣品基因組DNA甲基化水平，結果顯示超低溫保存后的材料中以去甲基化變異為主要趨勢。因此，低溫脅迫可能會導致植物基因組DNA發生去甲基化，因而DNA甲基化水平降低。

2.2.3 鹽脅迫的影響。鹽脅迫在農業生產領域嚴重制約著農業健康有序的發展，因此植物耐鹽適應性研究一直作為農業領域研究熱點［21］。Zhong等［22］采用 MSAP法檢測小麥耐鹽品種“德抗961”和鹽敏感品種“魯麥15”經鹽脅迫后根部的DNA甲基化變化情況，結果顯示，經鹽脅迫處理后DNA甲基化既有升高又有降低，以甲基化降低為主，由此推測，可能是甲基化降低改變染色體結構，調節基因表達，因而提高了植物的耐鹽性。Azadi等［23］用復合區間作圖法等分子標記技術繪制出在鹽脅迫條件下提高小麥糧食產量的數量性狀位點，這對提高小麥產量、促進糧食安全具有重要意義。

3 小麥在物理化學因素誘導下基因組DNA甲基化變化

誘發突變技術在農作物材料創制與品種培育中具有重要意義，在解決世界糧食安全問題上發揮了顯著作用。楊震等［24］采用60Co-γ射線處理小麥干種子，γ射線處理對幼苗的苗高和根長都有抑制作用，利用MSAP技術檢測小麥幼根和幼葉基因組DNA甲基化相對水平均發生變化，幼苗葉片的DNA甲基化水平相對下降，而根中則有所升高，由此推測，γ射線輻照會改變小麥基因組DNA甲基化方式，從而影響基因組穩定性。陳芳［25］用5-氮雜胞苷對小麥幼苗進行處理，結果表明，濃度在5～50 μmol/L的5-氮雜胞苷可以提高小麥分蘗能力，且影響抽穗、花期、千粒重等;100 μmol/L的5-氮雜胞苷對小麥根和苗生長有抑制效應;采用AFLP對其遺傳穩定性研究，結果顯示不同濃度5-氮雜胞苷以及處理過程中材料基因組均未發生變異;采用MSAP技術對處理前后樣品的DNA甲基化變化進行分析，5-氮雜胞苷處理后的材料均產生了不同程度的甲基化變化，以去甲基化變異為主，且DNA去甲基化的程度隨5-氮雜胞苷劑量增大而升高。

4 小麥在外源基因導入時基因組DNA甲基化變化

將外源物質轉移到小麥中，是小麥改良的重要途徑之一。遠緣雜交和多倍化是高等植物進化的主要動力，大多數種子植物在進化過程中都經歷了染色體加倍過程。鄒宏達［26］用熒光MSAP檢測體系，對小－大麥2H異附加系、小－大麥2H異代換系2H(2A)、2H(2B)及2H(2D)整套材料的基因組甲基化模式進行檢測，結果表明，大麥的2H染色體導入小麥基因中，導致小麥基因組的甲基化變異，且大麥2H染色體自身也檢測到了甲基化水平變化。對大米草及水稻等物種間遠緣雜交的研究表明，外源種質的導入可以引起受體基因組DNA甲基化程度及甲基化模式發生改變，雜種后代也會發生有別于親本的變異［27－28］。聶利紅等［29］以母本四倍體小麥SCAUP(AABB)與父本二倍體粗山羊草SQ523(DD)雜交得到人工異源六倍體小麥SCA/SQ(AABBDD)，采用MSAP技術分析小麥從四倍體到六倍體進化過程中甲基化水平及甲基化遺傳模式變化，結果顯示，F1代的甲基化水平均高于父本與母本，由此推測，小麥從四倍體到六倍體進化過程中對一些功能基因的甲基化來抑制其表達，從而降低異源多倍化造成的影響。

5 小麥的甲基轉移酶研究

DNA的甲基化是通過DNA甲基轉移酶催化和維持的。DNA甲基轉移酶是調節DNA甲基化的功能蛋白，在多種模式生物中的研究已相當廣泛。凌娜等［30］采用RACE技術克隆了小麥甲基轉移酶基因TaDnMT2，系統分析了該基因在小麥生長發育過程中的表達特性，TaDnMT2基因在不同發育時期的葉、種子及根系中均有較高水平表達，且表達的動態水平與發育進程有關，所以TaDnMT2可能在小麥生長與發育過程中發揮著調控作用。在甲基化參與春化過程已在多數物種得以驗證，閆延濤［31］在通過RACE技術克隆得到小麥甲基轉移酶基因基礎上，以春化處理為變量，研究得出春化后小麥甲基轉移酶基因的表達水平下降。這些研究方法為進一步研究甲基轉移酶在小麥中表達提供了參考。Thomas等［32］利用來自國際小麥基因組測序協會最新得到的小麥基因組，根據MET1基因序列特征在普通小麥中克隆得到TaMET1，并描述了TaMET1在小麥中的進化史，解釋同源染色體組II的優勢并解釋了DNA甲基化參與小麥基因組中的動力學機制。

6 展望

隨著全基因組甲基化測序技術的發展，可以在全基因組范圍內確定DNA甲基化的位置及其與基因調控間的關系。同時伴隨著小麥基因組測序結果的逐步發展，未來DNA甲基化在小麥遺傳育種中定會得到更加廣泛的應用。

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