一種檢測葡萄糖氧化酶活力的新方法

任婷月，周萬里，張利群，畢春元，李敬龍

1(齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟南，250353)

2(山東省科學(xué)院生物研究所山東省生物傳感器重點實驗室，山東濟南，250014)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一種氧化還原酶，在O2充足條件下，它能夠快速專一地催化β-D-葡萄糖為 β-D-葡萄糖酸和 H2O2［1］。它廣泛地分布于動物、植物和微生物體內(nèi)，微生物中的主要生產(chǎn)菌株有黑曲霉和青霉［2］。由于GOD天然無毒，無副作用，因而在食品，醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用極為廣泛。在食品工業(yè)方面，它能起到去除葡萄糖，脫氧保鮮，殺菌以及葡萄糖定量分析的作用［3］，如用于啤酒、果汁、奶制品等的除氧;魚、蝦、蟹等的保鮮;蛋品加工的脫糖;面制品的增筋等。

葡萄糖氧化酶在使用和科研實驗中都需要進行酶活力的測定。目前，它的測定方法主要有以下幾種，一種是滴定法［4］，此法雖然簡便易行，但是誤差比較大，靈敏度比較低;另外一種是連續(xù)分光光度法［5-6］，此法雖然靈敏度較高，但是測定值較低，且數(shù)據(jù)處理較復(fù)雜，成本較高;還有一種利用葡萄糖氧化酶-辣根過氧化物酶-苯胺衍生物或染料隱性體偶聯(lián)反應(yīng)體系測定［7］，這種方法非常靈敏，但也存在顯色不穩(wěn)定、短時間內(nèi)容易褪色，數(shù)據(jù)重復(fù)性不好等缺點，這樣就限制了葡萄糖氧化酶活力的測定在科研實驗中的應(yīng)用。本研究利用生物傳感分析儀檢測葡萄糖質(zhì)量濃度［8］的工作原理，設(shè)計了葡萄糖氧化酶活力的測定方法，用過氧化氫電極檢測葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H2O2的濃度從而得到葡萄糖氧化酶的活力單位［9］，用已知酶活力的葡萄糖氧化酶作標準檢測未知酶活力的葡萄糖氧化酶，在儀器上直接顯示酶活力單位，實現(xiàn)了葡萄糖氧化酶的快速測定，并與滴定法進行了對比研究。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

SBA-40C型葡萄糖生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所;梅特勒DELTA320pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;50 mL酸式滴定管，武漢華威化工儀器有限公司。

葡萄糖氧化酶標準液，用pH 6.5磷酸緩沖液配制成100 U/mL葡萄糖氧化酶液，2～8℃保存。

無水NaH2PO4，無水Na2HPO4，配制成0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液;0.1 mol/L標準HCl溶液和0.1 mol/L的標準NaOH溶液，按照國標GB/T601-2002標定。所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

無水葡萄糖，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖氧化酶，Sigma公司;稀釋水、SBA專用緩沖液，山東省科學(xué)院生物研究所自行研制;葡萄糖氧化酶液(＞1 500 U/mL)，山東省生物傳感器重點實驗室保藏。

1.2 工作原理

SBA-40C型生物傳感分析儀是以固定化酶為關(guān)鍵元件，由微電腦控制分析過程的智能化儀表，采用固定化葡萄糖氧化酶膜復(fù)合H2O2型電極測定葡萄糖的生化反應(yīng)如下:

酶反應(yīng)生成的H2O2透過酶膜后在鉑金電極表面失去電子，鉑電極獲得電子產(chǎn)生電流信號，此電流信號與H2O2的濃度成比例，而H2O2濃度與底物濃度成線性比例關(guān)系。通過比較被測物與標準樣品產(chǎn)生的H2O2量，就可計算出被測樣品中底物的含量。我們依據(jù)生物傳感分析儀測定葡萄糖質(zhì)量濃度的工作原理，設(shè)計了葡萄糖氧化酶酶活力的測定方法。

首先，用酶液替代待測液，然后，用含一定葡萄糖量的緩沖液替代原緩沖液(葡萄糖濃度保持過量)，最后，用空酶膜替代固定化的葡萄糖氧化酶酶膜，從而構(gòu)成一個檢測酶活的系統(tǒng)。測定時，用已知活性單位的葡萄糖氧化酶溶液標定儀器并進行線性校正，然后將待測樣品稀釋后進行測定，儀器顯示數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)即為被測定樣品中的葡萄糖氧化酶活力單位。

1.3 測定方法

1.3.1 葡萄糖氧化酶液樣品的制備

經(jīng)過實驗，對于過氧化氫電極法，葡萄糖氧化酶的活力范圍在0～100 U/mL時線性范圍關(guān)系較好，故將待測葡萄糖氧化酶液稀釋100倍進行酶活的測定。

用1 000 μL移液槍準確吸取待測酶液1 000 μL于80 mL小燒杯中，用少量pH 6.5的磷酸鹽緩沖液進行稀釋，然后用玻璃棒轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用pH 6.5的磷酸鹽緩沖液多次洗滌小燒杯，并將洗滌后液體全部轉(zhuǎn)移到容量瓶，最后定容到100 mL，得到酶液A1，用同樣的方法得到A2，A3，做平行實驗。

1.3.2 儀器定標和樣品測定

采用含葡萄糖1%，pH=6.5的磷酸鹽緩沖液作為流動相，充滿傳感器的管道和反應(yīng)池，采用100 U/mL葡萄糖氧化酶溶液作為標準液。開機后，用微量進樣器取25 μL葡萄糖氧化酶標準液迅速注入反應(yīng)池內(nèi)，20s后儀器顯示酶相對活性并自動清洗，清洗結(jié)束后再取25 μL上述標準液注入反應(yīng)池，如果2次測量誤差不超過2%，則提示定標通過，自動清洗后即可測定樣品，進樣量為25 μL，每個樣品重復(fù)測定3次。

葡萄糖氧化酶活力=樣品測定值×稀釋倍數(shù)

1.4 滴定法

對于滴定法，葡萄糖氧化酶的活力范圍在1.125～5.321 U/mL時線性范圍關(guān)系較好［10］，故將待測葡萄糖氧化酶液稀釋1 000倍進行酶活力的測定。

葡萄糖氧化酶液樣品的制備:用100 μL移液槍準確吸取待測酶液100 μL于80 mL小燒杯中，用少量pH 6.5的磷酸鹽緩沖液進行稀釋，然后用玻璃棒轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用pH 6.5的磷酸鹽緩沖液多次洗滌燒杯，并將洗滌液全部轉(zhuǎn)移到容量瓶，最后定容到100 mL，得到酶液B1，用同樣的方法得到B2，B3，做平行實驗。

滴定法具體操作步驟按照文獻［10］進行，每個酶液樣品平行測定3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳pH實驗

分別采用 pH 為 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸緩沖液作為流動相進行實驗，不同pH值的磷酸鹽緩沖液對葡萄糖氧化酶的活力測定的影響見圖1。結(jié)果表明:pH 6.5時的響應(yīng)值最高，所以選取pH 6.5的緩沖液進行實驗。

圖1 pH對測定結(jié)果的影響Fig.1 The effect of pH on the determination

2.2 線性實驗

首先，按照1.3.2的方法用25 μL，100 U/mL葡萄糖氧化酶標準液標定儀器，定標通過后，再取12.5 μL標準液注入反應(yīng)池，待反應(yīng)結(jié)束后，按動“線性校正”鍵，則儀器自動完成線性校正。然后，分別對0、20、40、60、80、100 U/mL 葡萄糖氧化酶標準樣品進行測定，測定結(jié)果見圖2。

以濃度作為X值，響應(yīng)值作為Y值進行回歸分析，得線性回歸方程:Y=1.001 4X+0.095 2，r=0.999 1。其中X為濃度，Y為響應(yīng)值，r為相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明:用本系統(tǒng)測定葡萄糖氧化酶活力時，進行線性校正后，進樣量在0～100 U/mL之間表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

圖2 線性實驗Fig.2 Test of lineary

2.3 精密度實驗

連續(xù)10次對100 U/mL的葡萄糖氧化酶樣品進行測定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明:精密度性實驗相對標準偏差(RSD)為0.63%，表明該檢測葡萄糖氧化酶活力的方法有較好的精確性。

2.4 回收率實驗

準備6份10 U/mL的葡萄糖氧化酶溶液，分別加入不同活力單位的葡萄糖氧化酶標準品，作回收率實驗，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，回收率在97.9% ～101.5%，相對標準偏差為1.51%，表明此方法檢測葡萄糖氧化酶活力具有良好的準確性。

表1 精密度實驗Table 1 Test for precision

表2 回收率實驗Table 2 Test for recovery

2.5 對比試驗

分別采用過氧化氫電極法與滴定法對實驗室保藏葡萄糖氧化酶液進行測定。

2.5.1 過氧化氫電極法

將葡萄糖氧化酶液稀釋100倍之后，測定結(jié)果見表3。

表3 過氧化氫電極法對葡萄糖氧化酶活的測定Table 3 The determination of glucose oxidase activity by hydrogen peroxide electrode method

2.5.2 滴定法

將葡萄糖氧化酶液稀釋1 000倍之后，測定結(jié)果見表4。

表4 滴定法對葡萄糖氧化酶活的測定Table 4 The determination of glucose oxidase activity by titration

實驗結(jié)果表明:由過氧化氫電極法所測的葡萄糖氧化酶活力為4 100 U/mL，由滴定法所測的葡萄糖氧化酶活力為4 111 U/mL，2種方法對葡萄糖氧化酶活力的測定結(jié)果相差不大，在誤差允許的范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本研究利用SBA-40C型生物傳感分析儀建立了一種葡萄糖氧化酶活力的快速測定方法，通過過氧化氫電極檢測葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H2O2的濃度從而得到葡萄糖氧化酶的活力單位，并采用該方法和滴定法對山東省生物傳感器重點實驗室保藏的葡萄糖氧化酶液進行了酶活測定。由結(jié)果可以看出:該檢測系統(tǒng)的最佳反應(yīng)pH為6.5，測定時間20 s，操作周期小于60 s，連續(xù)10次測定RSD值為0.63%，0～100 U/mL的范圍內(nèi)線性良好，r=0.999 1，并且該方法與滴定法的檢測結(jié)果相差不大，在誤差允許的范圍內(nèi)。滴定法是目前測定葡萄糖氧化酶活力的主要方法，但該方法存在操作步驟繁瑣，靈敏度較低等缺點，過氧化氫電極法快速，準確，專一性好，操作簡單，且精密度較高，是一種高效的分析方法。結(jié)果表明:用過氧化氫電極測定葡萄糖氧化酶的活力是一種理想的快速測定方法。

［1］ Wohlfahrt G，Trivi c'S，Zeremski J，et al.The chemical mechanism of action of glucose oxidase from Aspergillus niger［J］.Molecular and Cellular Biochemistry，2004，260(1):69-83.

［2］ 范一文，吳曉英.葡萄糖氧化酶的應(yīng)用研究［J］.飼料工業(yè)，2007，28(20):15-16.

［3］ 邢良英，王遠山，鄭裕國.葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)及應(yīng)用［J］. 食品科技，2007，24(6):24-30.

［4］ YANG Y M，WANG J W，TANR X.Immobilization of glucose oxidase on chitosan-SiO2gel［J］.Enzyme and Microbial Technology，2004，34(2):126-131.

［5］ Kouassi G K，Irudayaraj J，Mccarty G.Activity of glucose oxidase functionalized onto magnetic nanoparticles［J］.Bio Magnetic Research and Technology，2005，3(1):1.

［6］ Lee H U，Song Y S，Suh Y J，et al.Synthesis and characterization of glucose oxidase-core/shell magnetic nanoparticle complexes into chitosan bead［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2012，81:31-36.

［7］ 周建芹，陳韶華，王劍文.測定葡萄糖氧化酶活力的一種簡便方法［J］.實驗技術(shù)與管理，2008，25(12):58-60.

［8］ 孫士青，李智紅.酶電極法測定食品中葡萄糖含量的研究［J］. 營養(yǎng)學(xué)報，1998，20(2):229-233.

［9］ 史建國，周風(fēng)臻，楊明慧.用葡萄糖酶電極法測定葡萄糖淀粉酶活性的研究［J］.生物工程學(xué)報，1996，12(增刊):226-231.

［10］ 李丕武，劉瑜，李瑞瑞，等.兩種葡萄糖氧化酶活力的測定方法［J］. 食品工業(yè)科技，2013，34(12):71-80.