黑果枸杞中原花青素提取條件的優化與含量測定*

任小娜，陳志梅，曾俊，郭麗君，王玉濤

1(喀什師范學院生物與地理科學系，新疆喀什，844006)

2(喀什師范學院葉爾羌綠洲生態與生物資源研究高校重點實驗室，新疆喀什，844006)

原花青素是廣泛存在于植物中的一類天然多酚類化合物，具有水溶、無毒、無過敏、安全性好等特性，是一種天然的自由基清除劑和抗氧化劑，其抗氧化效果約為VE的50倍，VC的20倍，而且還有抗衰老、抗腫瘤、抗癌變、預防心腦血管疾病、預防動脈粥樣硬化等生理功能［1-4］。目前國際上還沒有統一的原花青素檢測方法，其定量分析常用比色法，應用較多的是香草醛法。

黑果枸杞是茄科枸杞屬的多年生耐鹽、抗旱植物，廣泛分布于我國陜西北部、內蒙古西部、寧夏、甘肅、青海、新疆和西藏等省區［5］。其成熟漿果中富含多種天然類多酚色素物質［6］。對黑果枸杞中的原花青素進行研究開發，不僅可以提高其經濟價值，而且對西部地區優勢特色植物資源開發有著積極的促進作用。目前關于黑果枸杞中原花青素的研究報道較少。因此本文對黑果枸杞中原花青素的提取方法進行了詳細的研究，并對不同產地的黑果枸杞中原花青素的含量進行了測定比較。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗原料

4種黑果枸杞，分別產自青海柴達木盆地、新疆精河縣、新疆塔什庫爾干縣和甘肅民勤縣，寧夏中寧縣紅果枸杞。5種枸杞均為2013年采摘的成熟期果實，采摘后，放入烘箱中105℃干燥處理并粉碎，分別置于自封袋中低溫避光保存。

1.2 主要實驗儀器與試劑

T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司;SHA-C電熱恒溫水浴振蕩箱，江蘇金壇億通電子有限公司;FA2204N電子天平，上海明橋精密科學儀器有限公司;TG16-WS離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司。

兒茶素標樣，購自中國食品藥品鑒定研究所;無水乙醇，香草醛，濃鹽酸均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 原花青素的提取方法

稱取一定量已粉碎好的黑果枸杞粉末，按照浸提液乙醇體積分數(%)、萃取反應時間(min)、萃取溫度(℃)、料液比(g∶mL)優化提取條件，于恒溫振蕩箱中振蕩萃取，反應結束后，取1 mL定容好的溶液，加入2.5 mL 1%的香草醛-乙醇溶液，再加入2.5 mL濃HCl，充分混勻后，立即在500 nm波長下測其吸光值［7］，并做空白試驗。每個處理平行試驗2次，計算平均值。

1.3.2 原花青素檢測方法

采用濃HCl-香草醛法制作標準曲線得出回歸方程，根據回歸方程計算原料中原花青素的含量。測定原理:原花青素和兒茶素類單體的A環的化學活性較高，在酸性條件下，其上的間苯二酚或間苯三酚與香草醛發生縮和，產物在濃酸作用下形成紅色的正碳離子，樣品的濃度與產生的顏色呈正相關，在500 nm波長下測定其吸收光值［8］。由于吸光值與原花青素的含量呈正比，因此，在最佳提取工藝的選取中，以吸光值的大小來衡量原花青素的含量。

2 結果與討論

2.1 原花青素的最佳提取工藝研究

2.1.1 不同體積分數乙醇對提取液吸光值的影響

分別稱取等量黑果枸杞粉末，加入不同體積分數的乙醇溶液30 mL，在50℃恒溫水浴震蕩箱中振蕩2 h，研究不同乙醇體積分數對提取液的吸光值的影響，結果如圖1所示。由圖1可以看出，隨著乙醇溶液體積分數的增加，提取液的吸光值逐漸增大然后減小，當乙醇體積分數為50%時，提取液的吸光值最大。根據有機溶劑“相似相溶原理”，原花青素的溶出度與溶劑的極性和本身的極性相關，極性相似可達到最大溶出度。因此選擇最佳的乙醇體積分數為50%。

2.1.2 不同的反應時間對提取液吸光值的影響

分別稱取等量黑果枸杞粉末，加入體積分數50%乙醇溶液30 mL，在50℃恒溫水浴振蕩箱中振蕩反應，研究反應時間對提取液吸光值的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，隨著反應時間的延長，提取液的吸光值逐漸增大。在0～10 min，吸光值迅速增加，在10～30 min，吸光值略有上升。在反應30 min時，提取液的吸光值達到最大，為0.768，30 min后，隨著反應時間的增加，提取液的吸光值趨勢趨于平緩。時間過短原花青素不能充分提取，時間過長導致原花青素酚羥基結構破壞，影響提取率，且又不夠經濟。為了充分提取出原料表面及內部的原花青素，提高原花青素提取率，選擇最佳提取時間為30 min。

2.1.3 不同的反應溫度對提取液吸光值的影響

分別稱取等量黑果枸杞粉末，加入體積分數50%乙醇溶液30 mL，于恒溫水浴震蕩箱中振蕩30 min，研究不同反應溫度對提取液吸光值的影響，結果如圖3所示。由圖3可知，隨著反應溫度的升高，提取液的吸光值先增大然后略有降低，在50℃時達到最大值。一方面，隨溫度升高，分子運動速度加快，其滲透、溶解和擴散速度加快，因此原花青素浸出速度加快，提取率增加;另一方面，原花青素為熱不穩定物質，高溫會使原花青素氧化破壞，穩定性減弱，高溫下提取液的吸光值呈現下降趨勢［9］。因此選擇最佳的反應溫度為50℃。

2.1.4 不同的料液比對提取液吸光值的影響

以體積分數50%的乙醇溶液作提取溶劑，在50℃恒溫水浴振蕩箱中萃取反應30 min，研究不同的料液比對提取液吸光值的影響。當反應結束后將提取液過濾，然后將濾液稀釋到相同的體積，測其吸光值，結果如圖4所示。

當料液比達到特定范圍時，擴散達到平衡，繼續增加溶劑量，萃取率也不會增加。當料液比為1∶15時(g∶mL)，吸光值達到最大，若再增大料液比，在過濾過程中，就會增大溶劑與過濾儀器的接觸面積，延長過濾時間，從而增加原花青素的過濾損耗。因此，料液比為1∶20(g∶mL)時，吸光值會略有降低。

2.1.5 最佳提取工藝確定

根據單因素的實驗結果，選擇L9(34)正交安排實驗，實驗方案設計見表1，正交表及極差分析結果見表2。

表1 L9(34)正交實驗設計方案Table 1 Design scheme in the L9(34)orthogonal experiments array

表2 正交實驗方案及結果分析Table 2 Arrangement and result analysis of orthogonal experiments

通過單因素實驗結果和正交實驗分析，結合實驗操作的便捷性和成本的經濟性，最終確定原花青素的提取條件為:反應溫度50℃，料液比1∶10(g∶mL)，乙醇體積分數50%，萃取時間40 min。

2.2 不同產地枸杞的原花青素含量測定

2.2.1 原花青素標準曲線的繪制

用60%乙醇水溶液配制濃度為1 mg/mL兒茶素標準液，分別取 0、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL，然后用體積分數60%乙醇定容至5 mL，配制成濃度分別為0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL 的兒茶素標樣，各取1 mL(體積分數60%乙醇作為空白)，分別加入2.5 mL 1%的香草醛-乙醇溶液，再加入2.5 mL濃HCl，充分混勻后，立即在500 nm波長下測其吸光值，繪制標準曲線。標準曲線見圖5，得到的回歸方程為:y=4.073 7x+0.003 2，R2=0.998 2。

2.2.2 不同產地枸杞中原花青素的含量

根據確定的原花青素最佳提取條件，對4種不同產地的黑果枸杞(青海、新疆精河、新疆塔縣、甘肅)和寧夏紅枸杞中原花青素進行提取，并根據標準曲線和回歸方程計算枸杞中原花青素的含量(見表3)。

由表3可知，不同品種枸杞中原花青素含量差別很大，寧夏紅枸杞中原花青素含量僅為0.18%，是甘肅黑果枸杞原花青素含量的1/7，是塔縣黑果枸杞原花青素含量的1/17;產自不同地域的黑果枸杞中原花青素含量差別也較大，范圍為1.21% ～2.99%，其中含量最低的是甘肅黑果枸杞，略低于新疆精河黑果枸杞中原花青素含量，而產自于新疆塔縣黑果枸杞的原花青素含量最高，為2.99%。這可能與物種自身特性和海拔高度、日照時間等生長環境有關，從而導致的枸杞中原花青素含量的地域差異性，今后還有待進一步研究。

表3 不同產地枸杞中原花青素的含量Table 3 The contents of procyanidins of Lycium barbarum from different producing area

3 結論

(1)以原花青素提取液的吸光值大小為衡量標準，通過單因素和正交優化試驗確定了黑果枸杞中原花青素的最佳提取條件:反應溫度50℃，料液比為1∶10(g∶mL)，乙醇體積分數50%，萃取時間40 min。

(2)采用濃HCl-香草醛法對4種不同產地的黑果枸杞和寧夏紅枸杞中原花青素的含量進行測定，其中寧夏紅枸杞中原花青素含量最低，僅為0.18%，不同產地黑果枸杞中原花青素含量為1.21%～2.99%，塔縣黑果枸杞中原花青素含量最高，為2.99%。

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