調節Lnk/干細胞因子-干細胞因子受體通路對糖尿病狀態骨髓間充質干細胞成骨功能的影響

李昊 周海倫 王琪 李偉

1.廣西醫科大學附屬口腔醫院口腔修復科，南寧 530021；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院（四川大學），成都 610041

近年來，糖尿病在人群中的發病率逐年升高。糖尿病患者長期高血糖狀態可引起身體多種組織、器官發生病變，糖尿病性骨疾病就是重要的并發癥之一。糖尿病患者易罹患骨質疏松、骨缺損愈合障礙等骨性疾病，導致牙槽骨快速吸收、拔牙創愈合遲緩等不良后果，嚴重影響多種口腔疾病治療的實施，其發病機制復雜，且常規治療往往效果不佳，如何治療糖尿病性骨疾病已成為臨床工作的難點之一。

隨著研究不斷深入，越來越多的資料顯示，糖尿病狀態下細胞成骨功能障礙是此類疾病發生的重要原因。作為新興細胞生物學研究中的重要細胞，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在牙槽骨等骨形成過程中的作用倍受矚目。連接蛋白Lnk是新發現的在干細胞信號轉導中有重要橋梁作用的蛋白，在多種病理狀態下高表達[1-2]，其下游的干細胞因子（stem cell factor，SCF）-干細胞因子受體（cKit）通路在多種干細胞遷移、分化等過程中起關鍵作用[3]。既往研究[4]表明，抑制Lnk的表達，調節Lnk/SCF-cKit信號通路可在骨折愈合過程中促進成骨。本研究擬用靶向Lnk的RNA干擾技術調節糖尿病狀態BMSCs的Lnk/SCF-cKit通路，并檢測BMSCs成骨功能的變化，探討改善糖尿病狀態BMSCs成骨功能的方法，為探尋糖尿病性骨疾病的治療措施提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

靶向干擾Lnk基因的shRNA（Dharmacon公司，美國），正義鏈5'-CGAGUUACCUCUUUCCUUA-3'。鏈脲佐菌（Sigma公司，美國），小鼠抗大鼠單克隆抗體Lnk、SCF、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型膠原蛋白a1（collagen typeⅠ a1，ColⅠa1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Santa Cruz公司，美國），兔抗大鼠多克隆抗體cKit（Abcam公司，美國），小鼠抗大鼠單克隆抗體CD11b、CD44、CD45、CD90、羊抗小鼠IgG抗體、羊抗兔IgG抗體、SP染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），Nikon 80i型顯微鏡（Nikon公司，日本），BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統（BIO-RAD公司，美國）。

1.2 構建大鼠糖尿病模型并分離培養BMSCs

SPF級4周齡SD雄性大鼠8只經過高糖食物喂養4周，空腹12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素（35 mg·kg-1體重），1周后取尾靜脈血檢測空腹血糖值，超過11.1 mmol·L-1者視為糖尿病模型構建成功[5]。大鼠形成糖尿病后，以常規鼠飼料喂養4周（每周測血糖確定糖尿病狀態），處死大鼠。

處死糖尿病大鼠后無菌條件下分離四肢長骨，放入αMEM培養基中漂洗。然后將長骨放入含10%青霉素/鏈霉素的αMEM培養基中去除表面軟組織，更換培養基后切斷干骺端并沖出骨髓，經過濾、離心后將所得細胞重懸于含10%胎牛血清及10%青霉素/鏈霉素的αMEM培養基中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中貼壁培養，獲得BMSCs。

正常BMSCs以相同方法取自與糖尿病大鼠相同周齡的8只正常大鼠（正常大鼠處死前均以常規鼠飼料喂食，處死前測定血糖確定未患糖尿病）。

1.3 免疫細胞化學染色鑒定BMSCs

如文獻[6]所述方法，將生長狀態良好的糖尿病大鼠及正常大鼠第3代細胞接種于蓋玻片上，制備細胞爬片。細胞爬片經40 g·L-1多聚甲醛固定，5 g·L-1Triton X-100孵育后，使用3%H2O2、封閉血清孵育，CD11b、CD44、CD45、CD90小鼠抗大鼠單克隆抗體（1︰200）作為一抗孵育，PBS代替一抗作為空白對照，二抗工作液孵育后進行DAB顯色劑顯色，采用免疫細胞化學技術檢測細胞表面標記物來鑒定細胞。陽性信號為細胞質或細胞核出現棕黃色顆粒。

1.4 RNA干擾BMSCs

選取生長狀態良好的第3代糖尿病大鼠BMSCs進行轉染。轉染前24 h將干細胞接種至24孔板，每孔接種3×105個細胞，細胞分為空白對照組、陰性對照組和RNA干擾組。空白對照組：不加任何干預措施；陰性對照組：用空載體質粒轉染BMSCs；RNA干擾組：用靶向Lnk基因的shRNA重組質粒轉染BMSCs。轉染后用含有4 mg·L-1嘌呤霉素的培養基進行陽性細胞篩選，獲得穩定轉染細胞。正常大鼠的BMSCs按相同方法進行轉染及篩選，細胞分為正常對照組、正常陰性組和正常干擾組。正常對照組：不加任何干預措施；正常陰性組：用空載體質粒轉染BMSCs；正常干擾組：用靶向Lnk基因的shRNA重組質粒轉染BMSCs。

獲得穩定轉染細胞后在成骨誘導前用免疫印跡實驗檢測BMSCs的Lnk及其下游SCF-cKit通路主要蛋白SCF、cKit的表達，檢測RNA干擾效果。收集各組細胞抽提蛋白后，以BCA法定量，即在96孔板中每孔加入蛋白標準品或蛋白樣品20 μL，每孔加入200 μL的BCA工作試劑，37 ℃溫育30 min，用酶標儀在562 nm檢測吸光度值，制作標準曲線并根據標準曲線計算蛋白樣品濃度。以每孔50 μg的上樣量加入各組蛋白，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelec-trophoresis，SDS-PAGE），濕轉后50 g·L-1脫脂牛奶封閉lh，Lnk、SCF、GAPDH小鼠抗大鼠單克隆抗體（1︰500）、cKit兔抗大鼠多克隆抗體（1︰600）作為一抗孵育2 h，羊抗小鼠或羊抗兔IgG抗體作為二抗（1︰3 000）孵育2 h，增強化學發光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影，分析BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統分析目的蛋白與內參GAPDH條帶的相對灰度值。每組細胞蛋白免疫印跡實驗重復6次。

1.5 誘導細胞成骨分化

獲得穩定轉染細胞后，將空白對照組、陰性對照組和RNA干擾組大鼠BMSCs在模擬糖尿病狀態的高糖成骨培養基中培養，進行成骨誘導，培養液為：含12 mmol·L-1葡萄糖的αMEM培養基，加入10%胎牛血清、10 nmol·L-1地塞米松、0.1 mmol·L-1抗壞血酸、1 mol·L-1β-甘油磷酸鈉。正常對照組、正常陰性組和正常干擾組BMSCs在普通成骨培養基中培養，進行成骨誘導，培養液為：標準αMEM培養基，加入10%胎牛血清、10 nmol·L-1地塞米松、0.1 mmol·L-1抗壞血酸、1 mol·L-1β-甘油磷酸鈉。

1.6 免疫印跡實驗檢測成骨誘導分化后細胞蛋白的表達

于成骨誘導28 d用免疫印跡實驗檢測各組BMSCs中Lnk及其下游SCF-cKit通路主要蛋白SCF、cKit以及成骨相關蛋白ALP、OCN、ColⅠa1的表達。收集細胞抽提蛋白，如1.4部分所述用BCA法定量后，進行SDS-PAGE凝膠電泳，Lnk、SCF、GAPDH小鼠抗大鼠單克隆抗體（1︰500），cKit兔抗大鼠多克隆抗體（1︰600），ALP、OCN、ColⅠa1小鼠抗大鼠單克隆抗體（1︰600）作為一抗孵育2 h，二抗（1︰3 000）孵育2 h，ECL顯影，分析目的蛋白與內參GAPDH條帶的相對灰度值。每組細胞蛋白免疫印跡實驗重復6次。

1.7 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差表示，采用成組設計方差分析進行各組間的比較，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫細胞化學染色鑒定BMSCs

染色結果顯示，分離培養的細胞表達CD44、CD90，不表達CD11b、CD45，符合BMSCs表面標記物特征（圖1）。

圖1 BMSCs中CD11b、CD44、CD45、CD90的表達 SP × 400Fig 1 Expression of CD11b, CD44, CD45 and CD90 in BMSCs SP × 400

2.2 大鼠的空腹血糖值

注射鏈脲佐菌素1周以后，糖尿病大鼠的空腹血糖值均高于11.1 mmol·L-1，平均值為（15.207±1.535） mmol·L-1，符合糖尿病模型構建成功標準。而正常大鼠的空腹血糖值均低于11.1 mmol·L-1，平均值為（5.416±1.102） mmol·L-1。處死大鼠當日，糖尿病大鼠的空腹血糖值均高于11.1 mmol·L-1，平均值為（17.362±2.217） mmol·L-1；正常大鼠的空腹血糖值均低于11.1 mmol·L-1，平均值為（5.791±0.834） mmol·L-1。

2.3 免疫印跡實驗檢測靶向Lnk的RNA干擾效果

與糖尿病各組相比，正常對照組低表達Lnk，高表達SCF、cKit（P＜0.05）；與空白對照組、陰性對照組BMSCs相比，RNA干擾組Lnk表達降低，SCF、cKit表達升高（P＜0.05）；空白對照組與陰性對照組相比，Lnk、SCF、cKit的表達無統計學差異（P＞0.05）；與正常對照組、正常陰性組BMSCs相比，正常干擾組Lnk表達降低，SCF、cKit表達升高（P＜0.05）；正常對照組與正常陰性組相比，Lnk、SCF、cKit的表達無統計學差異（P＞0.05）（圖2，表1）。

圖2 免疫印跡實驗檢測成骨誘導前各組BMSCs的蛋白表達Fig 2 Western blot analysis of different protein expression in BMSCsbefore osteogenic differentiation

表1 成骨誘導前各組BMSCs的蛋白表達Tab 1 Protein expression in BMSCs before osteogenic differentiation

2.4 免疫印跡實驗檢測誘導成骨分化后細胞蛋白的表達

誘導成骨分化28 d，與正常對照組BMSCs相比，糖尿病狀態各組BMSCs的Lnk表達水平高，SCF、cKit表達水平低，成骨相關蛋白ALP、OCN、ColⅠa1表達少（P＜0.05）；與空白對照組、陰性對照組BMSCs相比，RNA干擾組細胞Lnk表達減少，SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1的表達增加（P＜0.05）；空白對照組與陰性對照組相比，Lnk、SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1的表達均無統計學差異（P＞0.05）；與正常對照組、正常陰性組BMSCs相比，正常干擾組Lnk表達降低，SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1表達升高（P＜0.05）；正常對照組與正常陰性組相比，Lnk、SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1的表達無統計學差異（P＞0.05）（圖3，表2）。

圖3 免疫印跡實驗檢測成骨誘導28 d各組BMSCs的蛋白表達Fig 3 Western blot analysis of different protein expression in BMSCs 28 days after osteogenic differentiation

表2 成骨誘導28 d各組BMSCs的蛋白表達Tab 2 Protein expression in BMSCs 28 days after osteogenic differentiation

3 討論

糖尿病狀態使細胞成骨功能障礙，是糖尿病性骨疾病發生發展的重要原因。BMSCs存在于全身多個部位的骨組織中，可分化為成骨細胞、成軟骨細胞等，近年來發現BMSCs也存在于牙槽骨組織中，是牙槽骨生長代謝與缺損修復的細胞儲庫[7]，細胞外糖狀態、細胞因子等因素可影響BMSCs的成骨功能，進而改變骨組織的生長及缺損修復進程[8]。

近年來，Lnk因在多種干細胞的遷移、分化等過程中起重要調節作用受到越來越多的關注[1-2]。Lnk在其介導的細胞信號轉導系統中起重要的橋梁作用，溝通整條信號轉導通路。Lnk的表達變化能調節造血干細胞的增殖、內皮祖細胞的分化等多種病理生理過程[9]。有研究[2]顯示，靶向抑制正常成骨細胞的Lnk表達，可促進其骨向分化，并且抑制Lnk的表達可改善小鼠骨折愈合過程，促進骨折部位的骨形成，但其中的作用機制尚不明確。SCF-cKit信號通路是Lnk蛋白重要的下游通路之一，與組織細胞分化再生障礙關系密切[3-4]。Lnk蛋白Src同源區2結構可活化SCF，影響SCF與cKit特異性結合，激活cKit，介導下游通路細胞分化信號的轉導[10]。

本研究構建大鼠糖尿病模型并分離培養BMSCs，在體外RNA干擾Lnk的表達，觀察到在誘導成骨分化前后，與正常對照組相比，糖尿病狀態各組BMSCs高表達Lnk，低表達SCF、cKit；與空白對照組、陰性對照組相比，RNA干擾組Lnk表達減少，SCF、cKit表達增加，提示在糖尿病狀態下BMSCs的Lnk表達過度，下游SCF-cKit通路受到抑制，而靶向Lnk的RNA干擾能有效抑制BMSCs的Lnk表達，激活SCF-cKit通路。對正常大鼠BMSCs進行靶向Lnk的RNA干擾后，在誘導成骨分化前后，Lnk的表達降低，SCF、cKit的表達增加，提示在正常血糖狀態下抑制BMSCs的Lnk表達也可激活下游SCF-cKit通路。

目前已證實，ALP、OCN、ColⅠa1是成骨過程中的重要蛋白，ALP是骨形成所必需的酶，能反映細胞骨向分化、促進成骨的能力，是生物礦化和成骨樣細胞的特征性標記[11]；OCN是成骨過程中的一種特異蛋白，伴隨細胞向成骨細胞分化、成熟而逐漸表達增加；ColⅠa1是由骨形成細胞生產到骨基質中的主要有機成分，是成骨分化的又一重要標志物[12]。本研究結果可見，與正常對照組BMSCs相比，糖尿病狀態各組BMSCs表達ALP、OCN、ColⅠa1減少，且Lnk表達水平升高，SCF、cKit表達水平降低，提示在糖尿病狀態下存在BMSCs成骨分化障礙，并可能與Lnk/SCF-cKit信號通路激活異常有關。有研究[2,4]顯示，調節Lnk/SCF-cKit通路可促進成骨細胞形成鈣化結節，并促進骨形成。本實驗也觀察到，靶向抑制正常大鼠BMSCs的Lnk表達，可使細胞SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1的表達增加，提示調節Lnk/SCF-cKit信號通路可以促進正常BMSCs的成骨分化；而與糖尿病狀態其他各組細胞相比，RNA干擾組Lnk表達減少，SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1的表達增加，提示抑制Lnk的表達、激活下游SCF-cKit通路可能改善糖尿病狀態BMSCs的成骨分化，調節Lnk/SCF-cKit通路可能為治療糖尿病性骨疾病提供新思路。

致謝：本研究在廣西重點實驗室口腔頜面修復與重建研究實驗室中完成，感謝楊亦萍、卿海云、曹陽老師的實驗指導。

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