一種新的大鼠脊髓半離斷損傷模型*

齊 超李夏青張 宏

一種新的大鼠脊髓半離斷損傷模型*

齊 超①李夏青①?gòu)?宏①

目的：探討一種對(duì)機(jī)體影響較小、復(fù)制性良好的大鼠脊髓損傷模型，為后期藥物及干細(xì)胞干預(yù)脊髓損傷后修復(fù)提供條件。方法：采用改良注射針頭連接注射器作為損傷工具，在不打開(kāi)脊髓腔的前提下沿脊椎棘突左側(cè)垂直插入脊髓，造成大鼠腰髓一側(cè)離斷性損傷。除觀察動(dòng)物的一半行為學(xué)改變外，并對(duì)脊髓損傷后對(duì)大鼠的感覺(jué)功能（熱痛反應(yīng)）、運(yùn)動(dòng)功能（抓力測(cè)試）變化進(jìn)行定時(shí)觀測(cè)，以確定模型復(fù)制成功。結(jié)果：大鼠麻醉蘇醒后即刻出現(xiàn)一側(cè)后肢癱瘓、拖地行走，但無(wú)排尿及排便失禁，動(dòng)物一般狀態(tài)良好，后期未見(jiàn)合并感染，表明動(dòng)物模型復(fù)制成功。結(jié)論：用自制的注射器針頭造成的脊髓損傷模型操作簡(jiǎn)便、損傷較小、重復(fù)好，并且因與其折射相連，可在造模同時(shí)局部給予藥物或試劑進(jìn)行干預(yù)，為探索脊髓損傷再生困難的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

SD大鼠； 脊髓損傷； 脊髓半離斷術(shù)

脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）是指由于各種嚴(yán)重創(chuàng)傷直接或間接導(dǎo)致的脊髓損傷[1]。根據(jù)損傷的部位及受累神經(jīng)不同，其臨床表現(xiàn)不完全相同，多數(shù)患者出現(xiàn)脊髓損傷相應(yīng)節(jié)段以下的各種運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和括約肌難以恢復(fù)的功能障礙。通常脊髓損傷的程度和臨床表現(xiàn)取決于原發(fā)性損傷的部位和性質(zhì)，大多數(shù)患者伴有程度不等的肢體癱瘓，因此SCI是一種致殘率很高的臨床病癥。由于其本身的解剖結(jié)構(gòu)特征，脊髓損傷后很難再生修復(fù)，因此，尋找能夠刺激損傷脊髓神經(jīng)組織再生修復(fù)的新藥制劑及其探索脊髓損傷難以再生的分子機(jī)制是臨床及科研領(lǐng)域的重要任務(wù)之一。隨著社會(huì)各行業(yè)的快速發(fā)展，脊髓損傷的發(fā)病率也隨之增加。因此，對(duì)脊髓損傷的研究與關(guān)注仍是目前的熱點(diǎn)課題[2]。

脊髓損傷的動(dòng)物模型是進(jìn)行脊髓損傷與修復(fù)研究的必要基礎(chǔ)，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，脊髓損傷的模型有很多種，譬如：（1）挫傷性SCI（重力墮落性）；（2）切割或吸除型SCI；（3）脊髓壓迫性SCI模型；（4）光化學(xué)誘導(dǎo)性SCI模型；（5）牽拉性SCI模型等。然而，目前大多數(shù)SCI模型均存在有很多弊端。因此本實(shí)驗(yàn)旨在設(shè)計(jì)一種新型的大鼠脊髓損傷的模型，使其具有較高的穩(wěn)定性和可復(fù)制性，成為今后探討某些制劑對(duì)脊髓損傷的長(zhǎng)期影響的動(dòng)物模型[3]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取健康SD大鼠6只，體重180～200 g，正常飼料飼養(yǎng)，動(dòng)物使用及操作按照本校相關(guān)規(guī)則執(zhí)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)器械 手術(shù)刀片、持針鉗、蚊氏鉗、血管鉗、手術(shù)鑷、組織剪、縫針。

1.3 方法

1.3.1 SCI模型自制改良1 mL注射器針頭制備方法模型制作過(guò)程需要兩個(gè)注射器針頭，首先將其中一個(gè)注射器的針頭在石板上磨平并消毒，見(jiàn)圖1a；將另一個(gè)注射器針頭用持針器向著針頭斜面背側(cè)彎曲90°，被彎曲的針頭長(zhǎng)度為0.3 cm，見(jiàn)圖1b。

圖1 自制1 mL注射器針頭

1.3.2 SCI模型制備 （1）麻醉：采用無(wú)菌1％戊巴比妥鈉注射液腹腔注射，0.4 mL/100 g BW。（2）大鼠采用俯臥位放置手術(shù)平臺(tái)上，剃去背部毛發(fā)，并用碘酊消毒皮膚。（3）確定T10～T12位置：SD大鼠腰段脊椎棘突突出且斜向尾端，而胸段棘突則略呈直角狀向背側(cè)突出，因此，L1與T13棘突間有一個(gè)較大的裂隙，以此來(lái)判斷T9～T12的位置[4]。確定好位置后沿脊柱正中線、T9～T12部位切開(kāi)背部皮膚，約2～3 cm，分離脊柱表面的肌肉和筋膜，暴露T9～T12棘突和椎板。隨后，用組織剪和蚊氏鉗將T9～T10棘突左側(cè)的肌肉和韌帶剝離徹底暴露T9～T10的棘突和橫突，確定T9～T10間隙。（4）將磨平的1 mL注射器針頭（圖1a）從T10和T9間隙、緊靠棘突左側(cè)垂直插入脊髓腔并進(jìn)入脊髓，同時(shí)垂直上下抽插針頭，感覺(jué)有較大的活動(dòng)空間，表明針頭在脊髓腔內(nèi)，然后拔出針頭。由于脊髓腔內(nèi)為負(fù)壓，椎間隙為軟組織，因此進(jìn)針時(shí)不需太用力，針頭很容易進(jìn)入脊髓腔及脊髓。當(dāng)針頭進(jìn)入脊髓后，大鼠會(huì)劇烈抖動(dòng)。隨后，將彎曲的針頭（圖1b）從進(jìn)針點(diǎn)垂直插入，進(jìn)針時(shí)彎曲的針尖朝向左側(cè)。待針頭進(jìn)入脊髓腔后一直插入脊髓腔腹側(cè)壁，然后向脊髓左側(cè)小幅擺動(dòng)針頭3～4次，此時(shí)應(yīng)絕對(duì)避免彎曲的針頭超過(guò)棘突中線進(jìn)入右半側(cè)脊髓，由此只破壞左側(cè)脊髓。進(jìn)行此項(xiàng)操作時(shí)，左側(cè)（損傷側(cè)）后肢出現(xiàn)抽搐，拔出針頭前再進(jìn)行3～4次垂直抽插，以保證左側(cè)相應(yīng)斷脊髓嚴(yán)重離斷性損傷。最后輕緩地以垂直角度拔出針頭，此時(shí)脊髓半離斷模型建立步驟基本完成，見(jiàn)圖2。（5）手術(shù)完畢后縫合肌肉及皮膚，碘酊清潔局部并將大鼠置于干燥，清潔籠內(nèi)，大鼠清醒后在安靜，自然光條件下普通飼料喂養(yǎng)，并定期用碘酊清潔消毒創(chuàng)口。

圖2 脊髓T9～10進(jìn)針部位示意圖

1.3.3 觀察內(nèi)容 （1）動(dòng)物一般行為觀察：術(shù)后1 h，動(dòng)物清醒后單獨(dú)放置于飼養(yǎng)籠內(nèi)，容許自由活動(dòng)，觀察大鼠的日常行為活動(dòng)，如飲水、進(jìn)食、活動(dòng)能力、行走姿態(tài)和狀態(tài)以排泄情況等。（2）感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能測(cè)定：于術(shù)后24 h，1、2、3、4周分別對(duì)模型大鼠左側(cè)（損傷側(cè)）及右側(cè)（健側(cè)）后肢的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行檢測(cè)。感覺(jué)功能檢測(cè)采用熱痛敏感儀進(jìn)行測(cè)定，熱痛反應(yīng)時(shí)間用秒（s）表示，操作方法：將大鼠置于底面為玻璃面（可傳導(dǎo)熱）的方盒內(nèi)，待其處于安靜狀態(tài)后用發(fā)熱光源照射大鼠的后足底，這時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，直至其感到熱痛后抬足終止計(jì)時(shí)。運(yùn)動(dòng)功能測(cè)定采用嚙齒類(lèi)動(dòng)物抓力儀，抓力大小用克（g）表示，操作方法：大鼠抓持時(shí)應(yīng)輕拿輕放，避免將其激怒，左手將大鼠上半身抓住按放在抓力板上，右手拉住鼠尾，抓力板隨右手拉鼠尾的力量向前滑行，待動(dòng)物用力抓住抓力板時(shí)應(yīng)及時(shí)加力后拉，使其測(cè)到動(dòng)物的最大抓力。（3）脊髓一般形態(tài)學(xué)檢查及損傷部位確定：模型大鼠飼養(yǎng)4周后，采用4％的多聚甲醛灌注固定，沿背部脊柱中線自上而下切開(kāi)皮膚，減去脊柱周?chē)慕钅づc肌肉，充分暴露脊椎，用蚊氏鉗自脊椎尾端逐級(jí)打開(kāi)整個(gè)椎板，暴露髓腔和脊髓，觀察損傷所在部位及傷勢(shì)，同時(shí)取損傷脊髓段（包括損傷部位頭尾各0.5 cm）進(jìn)行冰凍切片及HE染色，觀察組織形態(tài)變化[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)中采集數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察指標(biāo)及感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能測(cè)定 正常大鼠四腳觸地，可直立。清醒后的脊髓半離斷術(shù)模型大鼠術(shù)后3～5 d手術(shù)切口處紅腫，數(shù)日后恢復(fù)正常。與正常大鼠進(jìn)行對(duì)比，模型動(dòng)物左側(cè)后肢癱瘓、拖地行走，且不能直立（圖3）。但大鼠可進(jìn)行正常日?；顒?dòng)，飲食及排泄均正常，術(shù)后并發(fā)癥少，且存活時(shí)間較長(zhǎng)，截止實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠一般狀態(tài)良好，對(duì)側(cè)肢體活動(dòng)正常。

圖3 模型大鼠術(shù)后左右側(cè)肢體行走狀態(tài)注：a：大鼠行走時(shí)左后肢運(yùn)動(dòng)功能喪失；b：大鼠側(cè)臥時(shí)顯示左后肢運(yùn)動(dòng)障礙

2.2 后肢熱痛實(shí)驗(yàn) 模型復(fù)制前大鼠兩側(cè)后肢熱痛實(shí)驗(yàn)皆為陽(yáng)性，脊髓損傷后，不同時(shí)間點(diǎn)的熱感刺激顯示，大鼠左側(cè)與右側(cè)后肢術(shù)后對(duì)熱敏感的刺激反應(yīng)明顯不同，損傷側(cè)動(dòng)物行熱刺激時(shí)，抬腿消失，熱敏實(shí)驗(yàn)陰性。而健側(cè)后肢對(duì)熱痛反應(yīng)消失后漸漸恢復(fù)，兩側(cè)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 脊髓損傷后不同時(shí)間段6只大鼠后肢熱痛反應(yīng)時(shí)間比較（±s） s

表1 脊髓損傷后不同時(shí)間段6只大鼠后肢熱痛反應(yīng)時(shí)間比較（±s） s

部位術(shù)前術(shù)后24 h術(shù)后1周術(shù)后2周術(shù)后3周術(shù)后4周左后肢9.56±1.82-----右后肢9.10±1.31-17.83±2.1517.12±1.1416.23±1.8215.89±1.38

術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠抓力實(shí)驗(yàn)于20：00進(jìn)行檢測(cè)。模型大鼠左側(cè)后肢在不同時(shí)間（術(shù)后24 h，1周，2周，3周，4周）的抓力明顯小于健側(cè)后肢（P＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），而且隨著模型復(fù)制時(shí)間的延長(zhǎng)，抓力并無(wú)明顯改變，見(jiàn)表2。

表2 脊髓損傷后不同時(shí)間段6只大鼠后肢抓力比較（±s） g

表2 脊髓損傷后不同時(shí)間段6只大鼠后肢抓力比較（±s） g

*與右后肢比較，P＜0.01

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通過(guò)對(duì)脊髓半離斷術(shù)后的大鼠進(jìn)行抓力和熱痛反應(yīng)試驗(yàn)可看出，手術(shù)前大鼠的雙后肢的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)能力均正常。手術(shù)后，隨著時(shí)間的推移，患側(cè)后肢的運(yùn)動(dòng)感覺(jué)和反射功能均無(wú)恢復(fù)，同時(shí)，健側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)能力不受影響，對(duì)熱痛覺(jué)沒(méi)有反應(yīng)，但隨著時(shí)間的推移，熱痛反應(yīng)可以漸漸恢復(fù)。因此，本模型的脊髓損傷是成功的，且為單側(cè)離斷性脊髓損傷，對(duì)大鼠造成感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能障礙；同時(shí)，根據(jù)脊髓形態(tài)定位，T9～T10棘突間隙插入針頭造成的損傷為腰髓部位的損傷，但該模型不伴有明顯的排泄障礙。

2.3 脊髓組織損傷定位及一般形態(tài)學(xué)觀察 肉眼觀察：術(shù)后24 h大鼠傷口處腫脹，1周后傷口愈合，4周時(shí)背部皮膚基本恢復(fù)正常。打開(kāi)脊椎椎板后可見(jiàn)針頭插入部位位于腰髓段，此處脊髓仍充血腫脹，脊髓組織軟化崩解。顯微鏡下觀察（HE染色）：術(shù)后大鼠脊髓的損傷區(qū)可見(jiàn)縱行脊髓纖維斷裂，損傷區(qū)域內(nèi)神經(jīng)結(jié)構(gòu)基本消失，髓鞘不可辨認(rèn)，見(jiàn)圖4。

圖4 大鼠損傷段脊髓縱切面HE染色注：a：脊髓縱切面×4HE染色；b：脊髓縱切面×10HE染色

3 討論

隨著轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)理念的引入，各種用于科學(xué)研究的動(dòng)物疾病模型應(yīng)更符合臨床實(shí)際，并能根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行藥物治療、行為干預(yù)及長(zhǎng)期療效觀察。因此，作為理想化的脊髓損傷模型應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：第一是能反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓損傷的神經(jīng)生理、運(yùn)動(dòng)行為的情況；第二是可以提供與臨床脊髓損傷一致或相似的動(dòng)物模型，即具有良好的臨床相關(guān)性：第三是模型要具有可復(fù)制性。研究脊髓損傷需大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這就需要制造模型的標(biāo)準(zhǔn)化[6]。以往文獻(xiàn)報(bào)道的常用的動(dòng)物脊髓損傷模型有下列幾種：（1）挫傷型脊髓損傷模型：此種脊髓損傷模型由相關(guān)學(xué)者在上個(gè)世紀(jì)初期首次設(shè)計(jì)的脊髓背側(cè)打擊模型[7]。該模型主要利用不同重量的砝碼從不同高度沿著套管垂直落下打擊大鼠脊髓背側(cè)造成不同程度的損傷。模型的最大不足之處在于影響因素復(fù)雜，操作重復(fù)性較差，譬如：同樣的勢(shì)能造成的損傷程度并不一致，且在打擊瞬間撞擊錘與脊髓相接觸的面積不一。（2）鉗夾型脊髓損傷：為一種急性脊髓擠壓性損傷模型[8]。模型主要是通過(guò)手術(shù)方式打開(kāi)SD大鼠椎板，用動(dòng)脈瘤夾鉗夾相應(yīng)的脊髓段。由于該方法需要去除椎板，對(duì)動(dòng)物損傷較大，同時(shí)感染機(jī)率較大，動(dòng)物常由于感染而發(fā)生死亡；另外由于鉗夾對(duì)脊髓損傷的力度不同，容易造成大鼠下肢全癱，對(duì)大鼠術(shù)后護(hù)理造成很多不便。（3）切割型脊髓損傷模型：與鉗夾型脊髓損傷模型類(lèi)似，也需要通過(guò)手術(shù)打開(kāi)椎板，暴露相應(yīng)脊髓[9]。脊髓暴露后，采用銳利的虹膜刀片或者顯微剪全橫斷或半橫斷脊髓。該模型手術(shù)步驟較復(fù)雜，對(duì)大鼠的損傷較大，且用刀片對(duì)脊髓的橫斷面較整齊，與臨床實(shí)際病例有一定差異。（4）脊髓缺血及再灌注模型：與前述脊髓損傷模型的不同在于，該模型主要采用夾閉降主動(dòng)脈造成脊髓缺血造成脊髓損傷[10]。但是阻斷脊髓供血的同時(shí)也造成了血管阻塞及其他組織器官的損傷，影響了隨后脊髓損傷行為學(xué)的觀察。

本實(shí)驗(yàn)中所采納的脊髓損傷模型與上述各種模型相比而言具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）皮膚創(chuàng)面較小，且不需打開(kāi)椎板進(jìn)行操作。由于不破壞椎板的完整性，因此大鼠出血量很少，術(shù)后很少發(fā)生椎管內(nèi)感染，動(dòng)物存活時(shí)間較長(zhǎng)。（2）利用自制改良的注射器針頭插入棘突間隙進(jìn)行損傷，操作難度較小，且定位準(zhǔn)確，損傷力度基本一致，既可以進(jìn)行半離斷性損傷，也可以進(jìn)行全離斷性損傷，由于損傷的可控性較好，術(shù)后并發(fā)癥較少。（3）注射器針頭造成的損傷屬于不規(guī)則性損傷，損傷斷端更符合臨床實(shí)際。（4）自制改良的1 mL注射器針頭容易制作，技術(shù)難度較小，操作容易，重復(fù)性較好，造成的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能障礙明顯[11]。另外，模型整體操作對(duì)大鼠的損傷小，傷口自愈時(shí)間短。（5）模型最大的特點(diǎn)是可以通過(guò)注射針頭所連接的注射器在損傷的部位注射藥物，對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或神經(jīng)干細(xì)胞等干預(yù)損傷，為探討臨床新的治療脊髓損傷的新藥制劑提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并可在此基礎(chǔ)上探討脊髓神經(jīng)損傷后再生機(jī)制。模型制作同時(shí)局部注射藥物或制劑進(jìn)行干預(yù)是本模型的獨(dú)特所在[12-13]。

總之，本模型的建立屬于大鼠脊髓損傷模型的新方法之一，主要解決現(xiàn)有模型中存在的諸多弊端。利用注射器針頭造成的脊髓損傷模型操作簡(jiǎn)便，損傷較小，重復(fù)性高，功能障礙顯著，同時(shí)，由于模型動(dòng)物術(shù)后感染機(jī)率低、并發(fā)癥少、存活率高、可重復(fù)性好，有良好的推廣使用前景。模型的建立為今后研究具有刺激或促進(jìn)脊髓再生的藥物或制劑提供了良好的條件及環(huán)境，為探索臨床藥物的分子作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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New Model for Lateral Lumbar Spinal Cord Injury in Rats

QI Chao，LI Xia-qing，ZHANG Hong.// Medical Innovation of China，2015，12（07）：014-017

Objective：To investigate a lateral spinal cord injury model with less trauma and better replication. The model would be usefull for the study of various new medicines or stem cell therapy on spinal cord injury.Method： A modified self-made needle was used to insert into lumbar spinal cord of SD rats without opening the cavum medullare，the lateral spinal cord injury was established.The grasping ability （movement function） and sensory function by temprature of hind-limbs were measured and compared with contralateral side at different time points after injury for insure the model was successfully.Result：It showed that lateral spinal cord injury model of rats appeared obvious lateral paralysis ，but without incontinence of urine and defecation. Also none of them had infection locally or systemically. The model was successfully.Conclusion：The spinal injure model made by self-made modified needle insertion into SD rats lumbar spinal cord is easy to handle ，repeat，and induce obvious lateral paralysis without severe complications.Due to its advantage of connecting， some medicines or stem cells could be injected conveniently at the same time while surgery processed，then provides an experimental basis to explore the molecular mechanism of spinal cord injury regeneration difficulty.

Sprague Dawley rat； Spinal cord injury； Spinal lateral amputation

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.07.005

2014-11-18） （本文編輯：周亞杰）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81171178）；山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012011036-3）；山西省留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2012-047）

①山西醫(yī)科大學(xué) 山西 太原 030001

李夏青

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China